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Abstract

Non-Hodgkin Lymphomas (NHL) represent one of the most common cancers worldwide. Among the most common forms of NHL are found Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), Diffuse Large B-cell Leukemia (DLBCL), and Follicular Lymphoma (FL). NHL is characterized by an expansion of myeloid cells with pro-tumoral properties, such as Tumor-associated macrophages (TAMs) or Myeloid-derived Suppressor Cells (MDSCs). However, little is known about the tumoral mechanisms leading to the expansion of those cell populations. It was recently suggested that small extracellular vesicles (sEVs) secreted by tumor cells may contribute to the polarization of myeloid cells. Indeed, the treatment of myeloid cells with CLL- derived sEVs leads to an upregulation of PD-L1 at the surface of myeloid cells and an increased secretion of pro-inflammatory cytokines. Interestingly, CLL-derived sEVs were enriched in yRNA4, a small non-coding RNA. Treatment of myeloid cells with yRNA4 induces a similar response of myeloid cells to treatment with CLL-derived sEVs. This effect depends on the Toll-Like Receptor (TLR) 7, a member of the TLR family, and may be relevant for all small RNAs contained in sEVs. In this dissertation, I first investigated the involvement of other TLR in response to treatment with CLL-derived sEVs. I searched for candidate sEV-proteins that could drive the polarization of myeloid cells into a pro-tumoral phenotype. In parallel, I investigated the role played by yRNA4 in the polarization of myeloid cells. As a first step, this dissertation presents a new approach for isolating and characterizing sEVs from human or murine lymphoid tissues. This approach combines differential centrifugation with size-exclusion chromatography, and turned out to be superior to previously used ultracentrifugation on a sucrose density cushion in terms of purity and yield of sEVs. A second step shows that the proteomic signature induced in myeloid cells following treatment with CLL-derived sEVs was broader than the signature induced in myeloid cells by yRNA4. The capacity of sEVs to induce a pro-inflammatory phenotype was tested using murine myeloid cells deficient for either TLR4, TLR7, or Myd88. Loss of TLR4 but not TLR7 nor Myd88 in myeloid cells leads to an impaired polarization of myeloid cells by tumor-derived sEVs. The activation of TLR2 and TLR4 following treatment with tumor-derived sEVs was also proven by using reporter cell assays. Next, I searched for potential TLR ligands present in NHL-derived sEVs. A proteomic comparison was performed with sEVs derived from the lymph nodes (LNs) of patients diagnosed with two subtypes of NHL, DLBCL and FL, as well as sEVs from patients with reactive lymph nodes as a non-tumoral control. Tumor LNs from DLBCL or FL patients were enriched in sEVs compared to reactive LNs. However, we observed a differential signature between the proteome of DLBCL-derived and FL-derived sEVs. Proteins unique to DLBCL- derived sEVs were primarily related to RNA processing, while proteins unique to FL-derived sEVs were more related to metabolism, among other pathways. Interestingly, sEVs from all 4 sources were found to be particularly enriched with Heat Shock Proteins (HSP), a family of proteins known to be endogenous ligands of TLRs. Finally, a knock-out of yRNA4 was induced using the CRISPR/Cas9 approach in the cell line HG-3, modeling CLL. The knock-out was validated using classical and real-time quantitative polymerase chain reactions and a Northern-blot assay. yRNA4 knock-out did not impair the capacity of the cells to secrete sEVs, nor their morphology, as investigated using transmission electron microscopy. However, sEVs derived from the yRNA4-deficient cell line showed a decreased capacity to induce the inflammatory phenotype in myeloid cells. The results raise the new hypothesis, that the reduced capacity of yRNA4-KO sEVs is due not only to the sole absence of yRNA4 but that the deletion of yRNA4 may impact the protein cargo loaded into the sEVs. Altogether, this dissertation allowed to decipher deeper the mechanisms by which tumor- derived sEVs influence the phenotype of myeloid cells. This mechanism was shown to be mediated by TLR2, TLR4 and TLR7; and the bioactive ligands include single-stranded RNAs such as yRNA4, as well as proteins, in particular the Heat-Shock Proteins. In the future, these findings may help finding new therapeutical targets to inhibit the modulation of the tumor microenvironment by tumor cells.

Translation of abstract (German)

Das Non-Hodgkin Lymphom (NHL) ist eine der häufigsten Krebsarten weltweit. Zu den weitverbreitesten Formen des NHL gehören die chronische lymphatische Leukämie (CLL), das diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) und das follikuläre Lymphom (FL). Eine Expansion myeloider Zellen mit tumorfördernden Eigenschaften wie tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) oder myeloiden Suppressorzellen (MDSC) ist charakteristisch für NHL. Allerdings ist wenig über die Mechanismen bekannt, welche zur Expansion dieser Zellpopulationen führen. Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die von Tumorzellen sezerniert werden, wurden kürzlich als möglicher Beitrag zu dieser Polarisierung myeloider Zellen vorgeschlagen. Tatsächlich führt die Behandlung von Monozyten mit CLL-abgeleiteten sEVs zu einer Hochregulation von PD-L1 auf der Monozytenoberfläche und einer erhöhten Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen. Interessanterweise war yRNA4, eine kleine nicht-kodierende RNA, in CLL- abgeleiteten sEVs angereichert. Behandlung von Monozyten mit yRNA4 induziert einen ähnlichen Effekt wie CLL-abgeleitete sEVs. Dieser Effekt ist abhängig von Toll-like-Rezeptor (TLR) 7, der zur Familie der TLRs gehört und womöglich für alle in sEVs enthaltenen kleinen RNAs relevant ist. In dieser Doktorarbeit untersuchte ich zunächst die Beteiligung anderer TLRs an der Reaktion auf Behandlung mit CLL-abgeleiteten sEVs. Ich suchte mögliche Kandidaten für sEV-Proteine, welche die Polarisierung der Monozyten in einen tumorfördernden Phänotyp antreiben. Parallel dazu ermittelte ich die Rolle von yRNA4 in der Polarisierung von Makrophagen. In einem ersten Schritt stellt diese Doktorarbeit einen neuen Ansatz zur Isolierung und Charakterisierung von sEVs aus humanem oder murinem lymphatischen Gewebe vor. Dieser Ansatz kombiniert differenzielle Zentrifugation mit Größenausschluss-Chromatographie und erwies sich in Bezug auf Reinheit und Ausbeute von sEVs als Verbesserung gegenüber der zuvor verwendeten Ultrazentrifugation mit Saccharose-Dichtekissen. Im zweiten Schritt wird gezeigt, dass die in Monozyten durch Behandlung mit CLL-abgeleiteten sEVs induzierte proteomische Signatur breiter gefächert als die durch yRNA4 induzierte Signatur ist. Das Vermögen von sEVs, einen tumorfördernden Phänotyp zu indizieren, wurde unter Verwendung von murinen Monozyten getestet, denen entweder TLR4, TLR7 oder Myd88 fehlte. Durch den Verlust von TLR4 kommt es zu einer beeinträchtigten Polarisierung der Monozyten durch Tumor-abgeleitete sEVs, was jedoch weder für TLR7, noch für Myd88 zu beobachten war. Zudem wurde die Aktivierung von TLR2 und TLR4 nach Behandlung mit Tumor-abgeleiteten sEVs durch Experimente mit Reporterzellen nachgewiesen. Des Weiteren sollten potentielle TLR Liganden, die in NHL-abgeleiteten sEVs vorhanden sind, identifiziert werden. Es wurde ein Vergleich der Proteome von sEVs durchgeführt, welche aus Lymphknoten (LN) von Patienten stammten, bei denen NHL mit den beiden Sybtypen DLBCL und FL diagnostiziert wurde. Als tumorfreie Kontrolle dienten sEVs von Patienten mit reaktiven 6 Lymphknoten. In Tumor-Lymphknoten von DLBCL- oder FL-Patienten waren sEVs im Vergleich zu reaktiven Lymphknoten angereichtert. Jedoch beobachteten wir für DLBCL- und FL-abgeleitete sEVs eine unterschiedliche Proteomsignatur. Proteine, die ausschließlich in DLBCL-abgeleiteten sEVs vorkamen, standen in erster Linie im Zusammenhang mit RNA- Prozessierung, während Proteine spezifisch für FL-abgeleitete sEVs neben anderen Signalwegen eher mit dem Metabolismus in Verbindung stehen. Interessanterweise waren in sEVs von jedem Ursprung insbesondere Hitzeschockproteine (HSP) angereichert, einer Familie von Proteinen, welche als endogene TLR-Liganden bekannt sind. Schließlich wurde ein Knockout der yRNA4 mit Hilfe eines CRISPR/Cas9 Ansatzes in der Zelllinie HG-3 induziert, welche als Modell für CLL dient. Dieser Knock-out wurde durch klassische und quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR) sowei einen Northern- Blot validiert. Der yRNA4-Knockout beeinträchtigte weder die Fähigkeit der Zellen, sEVs zu sezernieren, noch deren Morphologie, wie mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht wurde. Jedoch zeigten sEVs, die von der yRNA4-defizienten Zelllinie stammten, eine verminderte Fähigkeit zur Induktion des inflammatorischen Phänotyps in Monozyten. Auf Grund dieser Ergebnisse kommt die neue Hypothese auf, dass die reduzierte Induktion durch yRNA4-KO sEVs nicht nur auf das alleinige Fehlen der yRNA4 zurückgeführt werden kann, sondern die Deletion von yRNA4 auch die in sEVs geladene Proteinfracht beeinflusst. Zusammenfassend ermöglichte diese Doktorarbeit eine tiefergehende Analyse der Mechanismen, die dem Einfluss von sEVs auf den Phänotyp myeloider Zellen zu Grunde liegen. Es wurde gezeigt, dass dieser Mechanismus durch TLR2, TLR4 und TLR7 vermittelt wird. Bioaktive Liganden schließen sowohl einsträngige RNAs wie yRNA4 ein, als auch Proteine, insbesondere HSPs.