English Title: Design, synthesis and comparative study of mono- and multimeric EGFR (epidermal growth factor receptor)-specific peptides for the theranostic application in malignant transformations

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Abstract

Der Epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist ein wichtiges Target für die Bildgebung und Therapie bei einer Vielzahl von malignen Veränderungen. Derzeit sind jedoch noch keine Bildgebungsagenzien auf der Basis von Peptiden für diesen Rezeptor vorhanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Multimere (Homodi- und Homotetramer) des literaturbekannten Peptidliganden GE11 hinsichtlich ihrer EGFR-spezifischen Interaktion hergestellt und überprüft. Da sie meist überlegene Bindungseigenschaften verglichen mit denen der jeweiligen Monomeren aufweisen und aufgrund unterschiedlicher Liganden an verschiedene Rezeptoren binden können, wurde zusätzlich ein Heterodimer bestehend aus αVβ3-spezifischem c(RGDfK) und GE11 synthetisiert und ebenfalls untersucht. Des Weiteren wurden die literaturbekannten Peptide CPP, D4, EGBP, GE11, P1, P2, Pep11 und QRH sowie drei neue Peptide, Teilsequenzen des hEGF, EGF5-21, EGF13-32, EGF32 43, auf ihre Eignung als Basis für potentielle monomere Radiotracer für die PET/CT (Positronen-Emissions-Tomographie/Computer Tomographie) untersucht. Die Peptide wurden mit einem PEG5 Linker und dem Chelator NODA-GA funktionalisiert, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse untereinander zu garantieren, wonach die Substanzen mit [68Ga]Ga3+ markiert und in vitro bezüglich ihrer Serumstabilität, ihres 1 Octanol/WasserpH7.4-Verteilungskoeffizienten (logD(7.4)), Internalisierung in und EGFR-Bindungsaffinität an EGFR-überexprimierenden humanen Epithelkarzinomzellen A431 charakterisiert wurden. Die Peptidsynthese erfolgte an fester Phase nach Fmoc-Strategie, wobei die Vorteile einer ultraschallunterstützten oder mechanischen Kupplung anhand der Synthese des Heterodimers überprüft wurden. Die Markierungen mit [68Ga]Ga3+ wurden mittels analytischer Radio-HPLC verifiziert und ergaben nicht-optimierte molare Aktivitäten von 25 – 111 GBq/mymol mit radiochemische Reinheiten von ≥ 97%. Die radiomarkierten Peptide wiesen für die PET/CT geeignete logD(7.4)-Werte zwischen 2.17 ± 0.21 und 4.01 ± 0.13 und Serumsstabilitäten mit Halbwertszeiten von 62 bis zu 8078 min auf. In den in vitro-Evaluierungen an A431-Zellen konnte für keine der Substanzen eine EGFR-spezifische Internalisierung nachgewiesen werden. Ferner konnte in Konzentrationen bis zu 1 mM keine der Substanzen [125I]I-hEGF in kompetitiven Bindungsstudien von dem EGFR verdrängen. Unter den gleichen Bedingungen demonstrierten [125I]I-hEGF und hEGF eine hohe EGFR-spezifische Aufnahme in und Bindung an die A431-Zellen (33.6 ± 0.9% nach 1 h, reduzierbar auf 1.9 ± 0.2% durch Blockierung) und Affinität an dieselbe Zellinie (IC50-Wert: 15.2 ± 3.3 nM). Die Ergebnisse zeigen, dass 68Ga-markierte GE11-basierte Mono-, Homodi-, Homotetra- und Heterodimere wie auch 68Ga-markierte Monomere basierend auf den aktuell literaturbekannten Liganden zur EGFR-spezifischen Bildgebung nicht aussichtsreich ist und eine Entwicklung oder Identifizierung besser geeigneter Peptide, welche eine ausreichend starke Interaktion mit dem EGFR demonstrieren, erfolgen muss.

Translation of abstract (English)

The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is closely associated with tumor development and progression and thus an important target structure for imaging and therapy of various tumors. Currently, however, no peptide-based imaging agents are available for this receptor. In the present work, the published GE11 peptide was investigated in a multimeric (homodi- and homotetramer) form regarding its potential EGFR-targeting properties. Additionally, as they often exhibit superior properties compared to their monospecific counterparts and are able to simultaneously or complementarily address different receptor types, a heterodimer consisting of the αVβ3-specific c(RGDfK) and GE11 was synthesised and studied as well. Further, the EGFR targeting ability of published peptides CPP, D4, EGBP, GE11, P1, P2, Pep11 and QRH and three novel truncated hEGF ligands EGF5-21, EGF13-32, EGF32-43 was investigated to determine possible alternative radiolabeled monomeric candidates for the imaging of human malignancies by means of PET/CT (Positron Emission Tomography/Computed Tomography). In order to evaluate the synthesised peptides, they were functionalised with a PEG5 linker and NODA-GA chelator and subsequently radiolabeled with [68Ga]Ga3+ and characterised in vitro, determining their stability in human serum, 1 octanol/ waterpH7.4 partition coefficient (logD(7.4)), internalisation and binding affinity on EGFR overexpressing A431 epidermoid carcinoma cells. The peptides were synthesised on solid support according to standard Fmoc-strategy – also investigating the positive effects of ultrasonic-assisted compared to standard mechanical agitation-aided amino acid building block conjugation for the heterodimer. Subsequently, the developed ligands were successfully labeled with [68Ga]Ga3+ giving the radiolabeled products in non-optimised molar activites of 25 – 111 GBq/mymol in ≥ 97% radiochemical purity as determined by analytical radio-HPLC. The resulting radiotracers presented suitable logD(7.4) values between -2.17 ± 0.21 and -4.01 ± 0.13 as well as a stability in human serum sufficient for PET with serum half-lives of 62 up to 8078 min. During in vitro evaluations on A431 cells the substances showed no significant difference in internalisation of the labeled radiopeptides when comparing blocked and unblocked probes. Further, none of the agents were able to displace [125I]I-hEGF from the EGFR in competitive displacement assays in the same cell line in concentrations of up to 1 mM, whereas [125I]I-hEGF and hEGF demonstrated the expected high EGFR-specific tumor cell uptake (33.6 ± 0.9% after 1 h, being reduced to 1.9 ± 0.2% under blocking conditions) and affinity (IC50 value of 15.2 ± 3.3 nM) under identical conditions. The results indicate that the development of 68Ga-radiolabeled multimeric peptides based on GE11 and 68Ga-radiolabeled monomeric peptides based on current published ligands seems to hold no promise for EGFR mediated uptake into cells, necessitating the development or identification of a new suitable peptidic receptor ligand that exhibits a sufficiently strong EGFR interaction profile.