German Title: Mastomys coucha als präklinisches Modell zur Untersuchung der Makrophagen-gestützten DNA-Reparatur und der L2-basierten Kreuzvakzinierung im selben Tier

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Abstract

Non-melanoma skin cancer (NMSC) is the most commonly diagnosed skin cancer in Caucasians and develops at UV-exposed areas of the body. Particularly the development of SCCs is favoured by infection with human papillomaviruses (HPVs). HPVs have been shown to alter the immune response to prevent apoptosis of infected cells. L1-VLP-based vaccines have already been licensed to protect against high-risk HPVs, but these are limited in their cross-protection against cutaneous types. To study the impact of PV infections on both innate and adaptive immunity in detail, an immunocompetent animal model is required. Mastomys coucha represents such a natural preclinical model to study the development of NMSC. After infection with the species-specific Mastomys natalensis papillomavirus (MnPV) the animals develop benign skin tumours. During chronic UV exposure, MnPV-infected Mastomys develop SCCs in which Trp53 was found to be frequently mutated, potentially influencing DNA repair mechanisms after UVB irradiation. It has been reported that macrophages are able to increase DNA repair efficiency by secreting HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor). Based on these results, the innate immune system and its influence on DNA repair mechanisms after UV irradiation were investigated in the present study. Indeed, HB-EGF was shown to increase DNA repair efficiency in Mastomys fibroblasts, independent of the Trp53 status. In addition, the oncogene MnPV E7 was observed to upregulate the expression of the cytokine MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) after UV irradiation, suggesting that macrophage migration and activation may be stimulated. MnPV E7 further increases expression of pro-inflammatory cytokines after UV irradiation, which resembles a chronic inflammation in persistent infection. To investigate which signalling pathways are regulated after irradiation and HB-EGF treatment, proteomic analyses were performed. The molecular changes after 24 hours were limited, suggesting that the proteins responsible for the morphologically detectable effects had already returned to their normal levels. However, the upregulation of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) by stimulating the MAPK/ERK-signalling pathway was observed in p53-deficient cells. This protein, which is able to cleave the preform of HB-EGF, could lead to a positive feedback loop. In the second part of this thesis, the two HPV L2-based vaccines (HPV16 RG1-VLP and CUT-PANHPVAX) were tested in Mastomys coucha for their cross-protection against MnPV, in comparison to a mock control or MnPV L1-VLPs. Both L2-based vaccines provided protection in vivo, as the viral load in hair bulbs of vaccinated animals was lower compared to those of unprotected animals. In addition, cross-reactive antibodies against MnPV L2 could be detected for both vaccines, which also had a cross-neutralising effect against MnPV pseudoviruses in vitro. This study proves that next-generation L2-based vaccines are able to protect against PV infections even for different genera.

Translation of abstract (German)

Nicht-melanozytärer Hautkrebs (NMSC) ist der am häufigsten diagnostizierte Hautkrebs bei Kaukasiern und entwickelt sich an UV-exponierten Stellen des Körpers. Besonders die Entwicklung von SCCs wird durch eine Infektion mit humanen Papillomviren (HPV) begünstigt. Es wurde gezeigt, dass HPVs die Immunantwort verändern und die Apoptose infizierter Zellen verhindern. Zum Schutz gegen Hochrisiko-HPVs sind L1-VLP-basierte Impfstoffe bereits zugelassen, bieten jedoch nur einen begrenzten Kreuzschutz gegen kutane Typen. Um die Auswirkungen von PV-Infektionen auf die angeborene und adaptive Immunität im Detail zu untersuchen, ist ein immunkompetentes Tiermodell erforderlich. Mastomys coucha stellt ein solches natürliches, präklinisches Modell zur Untersuchung der Entwicklung von NMSC dar. Nach Infektion mit dem artspezifischen Mastomys natalensis Papillomavirus (MnPV) entwickeln die Tiere gutartige Hauttumore. Bei chronischer UV-Bestrahlung entwickeln MnPV-infizierte Mastomys SCCs, bei denen häufig eine Mutation von Trp53 festgestellt wurde, die möglicherweise die DNA-Reparaturmechanismen nach UVB-Bestrahlung beeinflusst. Es konnte gezeigt werden, dass Makrophagen in der Lage sind, die Effizienz der DNA-Reparatur zu erhöhen, indem sie HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor) sezernieren. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden in der vorliegenden Studie das angeborene Immunsystem und sein Einfluss auf die DNA-Reparaturmechanismen nach UV-Bestrahlung untersucht. In der Tat konnte gezeigt werden, dass HB-EGF die DNA-Reparatur-Effizienz in Mastomys-Fibroblasten unabhängig vom Trp53-Status erhöht. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass das Onkogen MnPV E7 nach UV-Bestrahlung die Expression des Zytokins MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) erhöht, was darauf hindeutet, dass die Migration und Aktivierung von Makrophagen stimuliert werden könnte. Zudem erhöht MnPV E7 die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen nach UV-Bestrahlung, was einer chronischen Entzündung bei persistierender Infektion ähnelt. Um zu untersuchen, welche Signalwege nach Bestrahlung und HB-EGF-Behandlung reguliert werden, wurden Proteomanalysen durchgeführt. Die molekularen Veränderungen nach 24 Stunden waren begrenzt, was darauf hindeutet, dass die für die morphologisch nachweisbaren Effekte verantwortlichen Proteine bereits wieder auf ihre normalen Werte zurückgegangen waren. Allerdings wurde in p53-defizienten Zellen eine Hochregulierung von Matrix-Metalloproteinase-3 (MMP-3) durch Stimulierung des MAPK/ERK-Signalwegs beobachtet. Dieses Protein, das in der Lage ist, die Vorform von HB-EGF zu spalten, könnte zu einer positiven Rückkopplungsschleife führen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die beiden HPV L2-basierten Impfstoffe (HPV16 RG1-VLP und CUT-PANHPVAX) in Mastomys coucha auf ihre Kreuzprotektion gegen MnPV im Vergleich zu einer Mock-Kontrolle oder MnPV L1-VLPs getestet. Beide L2-basierten Impfstoffe boten in vivo Schutz, da die Viruslast in den Haarwurzeln der geimpften Tiere im Vergleich zu denen der ungeschützten Tiere geringer war. Darüber hinaus konnten für beide Impfstoffe kreuzreaktive Antikörper gegen MnPV L2 nachgewiesen werden, die auch in vitro eine kreuzneutralisierende Wirkung gegen MnPV-Pseudoviren hatten. Diese Studie beweist, dass Impfstoffe der nächsten Generation auf L2-Basis in der Lage sind, vor PV-Infektionen zu schützen, auch bei verschiedenen Gattungen.