German Title: Epigenetische Regulation der Enhancer-Aktivität im Säugetiergenom.

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PDF, English (PhD Thesis by Elisa Kreibich) - main document Download (11MB) | Lizenz: Epigenetic regulation of enhancer activity in the mammalian genome by Kreibich, Elisa underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0

Abstract

Cell types are defined by their spatiotemporal gene expression patterns and their differential activity of promoters and enhancers. Enhancers are cis-regulatory elements in the DNA critical for the acquisition and maintenance of cellular identities by regulating the expression of key genes. Enhancers serve as landing pads for transcription factors (TFs) which are DNA-binding proteins that interpret the genomic code and enhance gene expression upon their binding. However, the underlying DNA sequence does not solely convey binding specificity, and therefore it is still largely elusive what additional factors regulate TF binding. An important regulatory layer in gene expression are dynamic and reversible epigenetic modifications of chromatin including DNA and histone proteins. To date, dozens of histone modifications have been identified that are associated with different genomic contexts and transcriptional states. For instance, histone H3 lysine acetylation has been generally associated with active chromatin as active enhancers and promoters, while histone H3 tri-methylation at lysine 23 (H3K27me3) is coupled to transcription repression. Yet, the causal contribution of such histone modifications to the regulation of enhancer activity and TF binding is still large unknown. To address this question, I developed a technical approach to analyse TF binding at DNA molecules where a certain histone modification of interest is present. For this, I combined a genomic enrichment technique with a single molecule footprinting (SMF) approach that allows to detect TF binding at single DNA molecule resolution. However, this experimental set-up paired with different optimization approaches did not produce high enough enrichments of DNA molecules harboring certain histone modifications to suffice the required statistical power. Therefore, the focus was laid on investigating the causal role of DNA methylation. DNA methylation in CpG context is the most common epigenetic modification in the mammalian genome that covers 70-80% of all CpG dinucleotides. Despite its prevalence, DNA methylation can be highly dynamic, especially at enhancer elements that exhibit reduced methylation levels during their activation. Previous studies have identified that the binding of TFs to enhancers is correlated with the partial loss in DNA methylation and it has been suggested that DNA methylation regulates enhancer activity. This hypothesis has remained elusive up to date, which has multiple reasons. First, the relationship between TFs and DNA methylation is bidirectional. Previous studies have identified many methyl-sensitive TFs in vitro whose binding is reduced upon methylation of their DNA binding motif. Some of those have been confirmed by in vivo studies, which showed that DNA methylation prevents the spurious binding of those TFs in the genome. Opposingly, TFs have also been identified to be directly responsible for the demethylation of enhancers. In consequence, the bidirectional regulation between DNA methylation and TF binding has prevented the establishment of a causal relationship between them. Second, the cell-to-cell epigenetic variability observed as intermediate methylation at enhancers elements makes common bulk-cell genomics approaches ineffective to identify a direct correlation between DNA methylation and TF binding and to determine whether DNA methylation generally contributes to the regulation of enhancer activity. In the here presented PhD project, I overcame these issues and limitation by advancing the single molecule footprinting (SMF) approach to resolve chromatin accessibility, TF binding, and simultaneously quantify the presence of DNA methylation on the same DNA molecules. By applying this technology across the murine genome, I demonstrate that TFs can bind most (>90%) enhancers irrespective of the underlying DNA methylation, suggesting that presence of DNA methylation does not generally impede enhancer activity. Yet, for stem cells and three somatic cell types, I identified active enhancers where TF occupancy is directly repressed by DNA methylation, including enhancers involved in the control of key cell identity genes. Using global perturbation assays and orthogonal enhancer activity measurements, I was able to show that at these active sites, DNA methylation directly controls the occupancy levels of TFs such as Max-Myc, that play a key role in the control of stem cell identity and proliferation. In the end, my data suggest a model where the function of DNA methylation extends beyond protecting the genome from spurious TF binding, by directly regulating the activation of cell-type specific enhancers. This detailed analysis is an important addition to our general knowledge on gene regulation and suggest that while epigenetic factors may have largely redundant functions, their individual contributions can play important and instructive roles in tuning the quantitative expression of key cell- specific genes. Understanding the regulation of such genes involved in cell identity will have important implications in the comprehension of development and disease.

Translation of abstract (German)

Zelltypen werden durch ihre raum-zeitlichen Genexpressionsmuster und ihre unterschiedliche Aktivität von Promotoren und Enhancern definiert. Enhancer sind cis-regulierende DNA Elemente, die für den Erwerb und die Aufrechterhaltung der zellulären Identität entscheidend sind, indem sie die Expression von Schlüsselgenen regulieren. Enhancer dienen als Bindungsplattformen für Transkriptionsfaktoren (TFs). Bei diesen TFs handelt es sich um DNA-bindende Proteine, die den genomischen Code interpretieren und die Genexpression nach ihrer Bindung an regulatorische Elemente verstärken. Die zugrundeliegende DNA-Sequenz ist jedoch nicht allein für die Spezifität der Bindung verantwortlich. Daher ist es noch weitgehend unklar, welche zusätzlichen Faktoren die TF- Bindung regulieren. Eine wichtige Regulierungsebene bei der Genexpression sind dynamische und reversible epigenetische Modifikationen des Chromatins, einschließlich der DNA und der Histonproteine. Bislang wurden Dutzende von Histonmodifikationen identifiziert, die mit verschiedenen genomischen Kontexten und Transkriptionszuständen in Verbindung gebracht werden. So wird beispielsweise die Histon-H3-Lysinacetylierung allgemein mit aktivem Chromatin wie aktiven Enhancern und Promotoren in Verbindung gebracht, während die Histon-H3-Tri-Methylierung an Lysin 23 (H3K27me3) mit der Transkriptionsunterdrückung verbunden ist. Der kausale Beitrag dieser Histonmodifikationen zur Regulierung der Enhanceraktivität und TF-Bindung ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Um diese Kausalitätsfrage zu klären, habe ich einen technischen Ansatz entwickelt um die TF-Bindung an DNA-Molekülen zu analysieren an denen bestimmte Histonmodifikationen vorhanden sind. Dazu habe ich eine genomische Anreicherungsmethode mit einer Methode der Einzelmolekül-Genomik (Single Molecule Footprinting, SMF) kombiniert, mit dem die TF-Bindung auf einzelnen DNA- Molekülen nachgewiesen werden kann. Diese Versuchsanordnung in Verbindung mit verschiedenen Optimierungsansätzen führte jedoch nicht zu einer ausreichenden Anreicherung von DNA-Molekülen mit bestimmten Histonmodifikationen, um die erforderliche statistische Aussagekraft zu erreichen. Daher wurde der Schwerpunkt der Dissertation auf die Untersuchung der kausalen Rolle der DNA- Methylierung gelegt. DNA-Methylierung im CpG-Kontext ist die häufigste epigenetische Modifikation im Genom von Säugetieren und findet sich auf 70-80% aller CpG-Dinukleotide. Trotz ihrer weiten Verbreitung kann die DNA-Methylierung sehr dynamisch sein, insbesondere an Enhancer-Elementen, die während ihrer Aktivierung reduzierte Methylierungswerte aufweisen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bindung von TFs an Enhancer mit dem teilweisen Verlust der DNA-Methylierung korreliert, und es wurde vermutet, dass die DNA-Methylierung die Enhancer-Aktivität reguliert. Diese Hypothese ist bis heute nicht eindeutig geklärt, was mehrere Gründe hat. Erstens ist die Beziehung zwischen TFs und DNA-Methylierung bidirektional. In früheren Studien wurden viele methylierungsempfindliche TFs in vitro identifiziert, deren Bindung bei Methylierung ihres DNA-Bindungsmotivs reduziert wird. Einige von ihnen wurden durch In-vivo-Studien bestätigt, die zeigten, dass die DNA-Methylierung die unerwünschte Bindung dieser TFs im Genom verhindert. Umgekehrt wurden auch TFs identifiziert, die direkt für die Demethylierung von Enhancern verantwortlich sind. Folglich hat die bidirektionale Regulierung zwischen DNA-Methylierung und TF-Bindung bisher verhindert, dass eine kausale Beziehung zwischen ihnen hergestellt werden konnte. Zweitens macht die epigenetische Variabilität von Zelle zu Zelle, die als intermediäre Methylierung an Enhancer-Elementen beobachtet wird, herkömmliche Genomikansätze für Zell-Populationen unwirksam, um eine direkte Korrelation zwischen DNA-Methylierung und TF-Bindung zu identifizieren und zu bestimmen, ob DNA- Methylierung generell zur Regulierung der Enhancer-Aktivität beiträgt. In dem hier vorgestellten Dissertationsprojekt habe ich diese Probleme und Einschränkungen überwunden, indem ich den Single Molecule Footprinting (SMF)-Ansatz weiterentwickelt habe, um die Chromatin-Zugänglichkeit und die TF-Bindung zu bestimmen und gleichzeitig das Vorhandensein von DNA-Methylierung auf denselben DNA-Molekülen zu quantifizieren. Durch Anwendung dieser Technologie auf das Mausgenom konnte ich zeigen, dass TFs die meisten (>90%) Enhancer unabhängig von der zugrunde liegenden DNA-Methylierung binden können, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von DNA-Methylierung die Aktivität von Enhancern nicht generell behindert. Für Stammzellen und drei somatische Zelltypen habe ich jedoch aktive Enhancer identifiziert, bei denen die TF-Bindung direkt durch DNA-Methylierung unterdrückt wird, darunter auch Enhancer, die an der Kontrolle wichtiger Zellidentitätsgene beteiligt sind. Mithilfe genomweiter Veränderungen der DNA-Methylierung und orthogonaler Messungen der Enhancer-Aktivität konnte ich zeigen, dass die DNA-Methylierung an diesen aktiven Stellen direkt die Binding von TFs wie Max-Myc kontrolliert, die eine Schlüsselrolle bei der Steuerung der Stammzellidentität und -vermehrung spielen. Letztlich legen meine Daten ein Modell nahe, bei dem die Funktion der DNA-Methylierung über den Schutz des Genoms vor ungewollter TF-Bindung hinausgeht, indem sie die Aktivierung zelltypspezifischer Enhancer direkt reguliert. Diese detaillierte Analyse ist eine wichtige Ergänzung unseres allgemeinen Wissens über die Genregulierung und lässt vermuten, dass epigenetische Faktoren zwar weitgehend redundante Funktionen haben, ihre einzelnen Beiträge aber wichtige und instruktive Rollen bei der Abstimmung der quantitativen Expression wichtiger zellspezifischer Gene spielen können. Das Verständnis der Regulierung solcher Gene, die an der Zellidentität beteiligt sind, wird wichtige Auswirkungen auf das Verständnis von Entwicklung und Krankheit haben.