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Abstract

Psychiatric disorders such as schizophrenia or major depression are often associated with specific congenital genetic variants. One of these variants, which has been associated with that kind of disorder, is the human-specific single nucleotide polymorphism (SNP, rs6265) in the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) gene. About 30 to 60% of the worldwide population is either homo- or heterozygous for this SNP which is located at codon 66 in the pro-domain of the protein (Val66Met). It results in a substitution of valine (Val) to methionine (Met) that impairs the intracellular trafficking as well as the activity-dependent release of the protein. BDNF, a member of the neurotrophin family, is known to be important in brain development being involved in neuronal survival, neurite outgrowth and synaptic plasticity. The aim of this thesis was to investigate the effects of the Val66Met polymorphism on BDNF trafficking, neuronal morphology and function on an endogenous expression level in humaninduced pluripotent stem cell (iPSC)-derived neuronal cultures generated from healthy donors homozygous for either the BDNFVal or BDNFMet variant. To account for the given genetic heterogeneity of humans, I additionally generated isogenic cell lines using CRISPR/Cas9 gene editing. Analysis of BDNF localization revealed a decreased number of BDNF+ vesicles on neurites of BDNFMet/Met neurons compared to BDNFVal/Val neurons. Interestingly, the BDNF signal was accumulated at the soma of BDNFMet/Met neurons, indicating impaired trafficking of BDNFMet. Furthermore, a significant reduction in neurite length and complexity in neurons derived from BDNFMet/Met carriers at early developmental stages was observed. This was persistent up to later stages of development and could be rescued by external application of recombinant BDNF. The morphological alterations were accompanied by a reduced synaptic density in BDNFMet/Met neurons analyzed by immunocytochemistry. These results were confirmed by functional characterization including calcium imaging and electrophysiological measurements that showed an altered synaptic function in neurons carrying BDNFMet/Met. Taken together, my data provide first experimental evidence identifying morphological and neurophysiological differences in human neurons carrying the BDNF Val66Met polymorphism. My work demonstrates that human iPSC-derived cortical neurons can be used as a cellular model to recapitulate previous results gained with animal studies, but also to highlight humanspecific aspects, which might help to strengthen our understanding of BDNF signaling.

Translation of abstract (German)

Psychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie oder Bipolare Störung werden oft mit spezifischen Risikogenen in Zusammenhang gebracht. Eine Variation, die immer wieder mit diesen Krankheiten assoziiert wird, ist der humanspezifische SNP (rs6265) im BDNF Gen, der bei 30 bis 60 % der Bevölkerung auftritt. Dabei handelt es sich um eine Aminosäuresubstitution von einem Valin zu einem Methionin (Val66Met) in der Prodomäne des Proteins. Diese Veränderung führt zur Beeinträchtigung des intrazellulären Transports sowie der aktivitätsabhängigen Sekretion von BDNF. Der Wachstumsfaktor BDNF, welcher im Gehirn weit verbreitet ist, spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung, der Differenzierung sowie dem Überleben von verschiedenen neuronalen Populationen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die endogene Auswirkung dieses Polymorphismus auf den Transport von BDNF, die Morphologie und neuronale Funktion in humanen iPSC-abgeleiteten neuronalen Kulturen untersucht. Dabei waren die Neuronen entweder homozygot für die BDNFVal oder die BDNFMet Variante. Außerdem wurden isogene Linien mittels CRISPR/Cas9- Geneditierung generiert, um die gegebene genetische Heterogenität des Menschen zu berücksichtigen. BDNF ist in den Neuronen axonal und somatodendritisch vorhanden und colokalisiert mit dem „dense-core“ Vesikel Marker secretogranin II (SCG2), wodurch von einer regulierten Sekretion ausgegangen werden kann. Des Weiteren wurde die Menge an BDNF in den Neuriten quantifiziert. Dabei sind mehr BDNF+ Partikel in BDNFVal/Val Neuronen als in BDNFMet/Met Neuronen vorhanden. Stattdessen scheint BDNFMet im Soma zu akkumulieren, was auf einen beeinträchtigten Transport von BDNFMet hinweist. Die anschließende Analyse des Neuritenwachstum zeigte auf, dass endogenes BDNFMet zu einer signifikanten Reduktion der Neuritenlänge, sowie der Verzweigungen in Neuronen führt. Diese hält bis zu späteren Entwicklungsstadien an und konnte durch externe Anwendung von rekombinantem BDNF behoben werden. Die morphologischen Veränderungen wurden von einer verringerten synaptischen Dichte sowie neuronalen Aktivität in BDNFMet/Met Neuronen begleitet. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die hier untersuchten Zelllinien ein geeignetes in vitro- Modell zur Untersuchung der Funktion von BDNF und des Val66Met Polymorphismus in humanen Neuronen darstellen. Sie sind in der Lage bisherige Ergebnisse aus der Tierforschung zum Großteil zu rekapitulieren, identifizieren jedoch auch humanspezifische Aspekte, die dazu beitragen könnten, unser Verständnis der BDNF-Signalübertragung zu stärken.