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Abstract

Methylglyoxal (MG) is a byproduct of glucose metabolism that displays high reactivity with many biological macromolecules, in particular proteins, giving rise to adducts known as advanced glycation end products (AGEs). Increased MG and AGEs are commonly observed in diabetes and, among diabetic patients, those affected by diabetic complications show the highest levels of MG and MG-adducts, raising the possibility that, besides hyperglycemia, a buildup of MG could play a direct causative role in the development of diabetes and its complications. Indeed, findings in Drosophila melanogaster and Danio rerio showed that disruption of glyoxalase I (Glo1), the rate limiting enzyme for MG detoxification, causes features of type 2 diabetes such as insulin resistance, hyperglycemia and obesity . Understanding how the activity of Glo1 is regulated and how exactly MG affects cellular metabolism is thus of the utmost importance to determine how MG detoxification goes awry in diabetes and how the ensuing MG accumulation contributes to the metabolic alterations typical of this disease. To this end, I worked on two complementary lines of investigation aimed at (1) assessing the role of post-translational modifications in the regulation of Glo1 activity and (2) studying which metabolic pathways are affected by high levels of MG in vitro and in mouse models of diabetes. My results show that phosphorylation of Glo1 at Y136 by multiple kinases, including those belonging to the Src family, promotes Glo1 activity. Consistent with impaired detoxification of MG in the pathogenesis of diabetes, I observed that phosphorylation at this residue and overall Glo1 activity are decreased when cells are cultured in high glucose (25 mM), as well as in diabetic mouse models. To study the metabolic alterations caused by MG, I generated cell lines knockout for Glo1 or acutely treated control cells with MG. Interestingly, chronic or acute exposure to MG was sufficient to increase glucose uptake, lactate production and impair fatty acid -oxidation. I found that MG inhibits the activity of pyruvate dehydrogenase (PDH), probably accounting for the increased glucose uptake and lactate production. The effect of MG on PDH activity is not mediated by altered phosphorylation of PDH, a well-established mode of regulating PDH activity, but rather by direct interaction of MG with the pyruvate dehydrogenase α (PDHA) subunit of PDH, together with formation of a DTT-sensitive modification on the PDH subunit dihydrolipoamide acetyltransferase (DLAT). I also observed decreased PDH activity in mouse models of diabetes, further strengthening the link between accumulation of MG and impaired PDH activity. Overall, my data point to a deleterious positive feedback loop whereby hyperglycemia leads to reduced Y136 Glo1 phosphorylation and activity, contributing to elevated MG levels,inhibition of PDH and changes of cellular metabolism to promote hyperglycemia and thus further production of MG.

Translation of abstract (German)

Methylglyoxal (MG) ist ein Nebenprodukt des Glukosestoffwechsels, welches eine hohe Reaktivität mit vielen biologischen Makromolekülen, insbesondere Proteinen, aufweist. Dadurch entstehende Addukte werden als fortgeschrittene Glykationsendprodukte (AGEs) bezeichnet. Erhöhte Konzentrationen von MG und AGE werden häufig bei Diabetes beobachtet. Diabetiker, die von diabetischen Komplikationen betroffen sind, weisen dabei die höchste Menge an MG und MG-Addukten auf. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass neben Hyperglykämie ein Anstieg von MG eine direkte Rolle bei der Entwicklung von Diabetes und seinen Komplikationen spielen könnte. Studien mit Drosophila melanogaster und Danio rerio zeigten, dass die Störung von Glyoxalase I (Glo1), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym für die MG-Entgiftung, zum Auftreten von Merkmalen von Typ-2-Diabetes wie Insulinresistenz, Hyperglykämie und Fettleibigkeit führt. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie die Aktivität von Glo1 reguliert wird und wie genau MG den Zellstoffwechsel beeinflusst, um festzustellen, inwiefern die MG-Entgiftung in Diabetes beeinträchtigt ist und wie die daraus resultierende MG-Akkumulation zu den für diese Krankheit typischen Stoffwechselveränderungen beiträgt. Zu diesem Zweck habe ich in meiner Doktorarbeit an zwei komplementären Ansätzen gearbeitet, die darauf abzielten, (1) die Rolle posttranslationaler Modifikationen bei der Regulation der Glo1-Aktivität festzustellen und (2) zu untersuchen, welche Stoffwechselwege von akuten oder chronisch hohen MG-Spiegeln in vitro und in Diabetes-Mausmodellen betroffen sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorelierung von Glo1 an Y136 durch mehrere Kinasen, einschließlich Mitglieder der Src-Familie, die Enzymaktivität steigern. In Übereinstimmung mit der beeinträchtigten Entgiftung von MG in der Pathogenese von Diabetes konnte ich zeigen, dass diese Glo1 Phosphorylierung und Glo1-Aktivität in Diabetes-Mausmodellen verringert sind und wenn Zellen in Medium mit hoher Glukose Konzentration (25 mM) kultiviert werden. Um die durch MG verursachten metabolischen Veränderungen zu untersuchen, generierte ich Knockout- Zelllinien für Glo1 oder behandelte Zellen akut mit MG. Interessanterweise reichte eine chronische oder akute Exposition von Zellen mit MG aus, um die Glukoseaufnahme und die Laktatproduktion zu erhöhen und die β-Oxidation von Fettsäuren zu beeinträchtigen. Ich fand heraus, dass MG die Aktivität der Pyruvatdehydrogenase (PDH) hemmt, was vermutlich für die erhöhte Glukoseaufnahme und Laktatproduktion verantwortlich ist. Die Wirkung von MG auf die PDH-Aktivität wird dabei wahrscheinlich nicht durch eine veränderte Phosphorylierung von PDH verursacht, einem gut beschriebenen Mechanismus zurRegulierung der PDH-Aktivität, sondern vielmehr durch eine direkte Wechselwirkung von MG mit der PDH Untereinheit Pyruvatdehydrogenase α (PDHA) zusammen mit der Bildung einer DTT-empfindlichen Modifikation auf der PDH Untereinheit Dihydrolipoamidacetyltransferase (DLAT). Weiterhin habe ich eine verringerte PDH-Aktivität in Mausmodellen für Diabetes beobachtet, was die Verbindung zwischen der Akkumulation von MG und einer beeinträchtigten PDH-Aktivität weiter verstärkte. Insgesamt weisen meine Daten auf eine schädliche, positive Rückkopplungsschleife hin, bei der Hyperglykämie zu einer verringerten Y136-Glo1-Phosphorylierung und daher Glo1-Aktivität führt, was wiederum zu einer erhöhten MG Konzentration, zu einer Inhibierung von PDH und letztendlich zu einer Veränderungen des Zellstoffwechsels führt. Dies fördert Hyperglykämie und damit erneut eine verstärkte Produktion von MG.