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Abstract

Neuromuscular junctions (NMJs) are synapses in the peripheral nervous system where signals are transmitted from spinal motoneurons to skeletal muscle fibers, enabling locomotion. Numerous in vitro models for NMJs have been developed to investigate their formation, function, and disease mechanisms. In addition to motoneurons and muscle fibers, the NMJ also consists of other cell types, in particular, glial cells of Schwann cell origin. Although these are critical for all of the aforementioned processes, Schwann cells have not yet been integrated into neuromuscular in vitro models in a targeted manner, primarily due to limitations regarding the efficient generation of human Schwann cells in vitro. To address this, an optimized protocol for robust and efficient generation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived Schwann cells is presented in this thesis. To achieve this, a number of different modifications to a published differentiation protocol were tested. The activation of BMP signaling to a precisely tuned intermediate level proved to be important for the efficient generation of neural crest cells, which could be differentiated into Schwann cells subsequently. In addition, improved cell maturation was achieved using a defined culture medium, demonstrated by expression of typical Schwann cell marker proteins. This medium also promoted maturation of both hiPSC-derived motoneurons and murine cell line-derived myotubes, and was therefore compatible with neuromuscular tricultures. Using pre differentiated precursor cells, a protocol was established to combine all three cell types and culture them for several days. In such tricultures, Schwann cells aligned with motoneurons, and both were found to colocalize with nAChR clusters on myotubes and to influence their formation. Additionally, different approaches for multicellular and spatially organized neuromuscular cultures in 3D hydrogels were explored. Overall, this thesis provides the tools for selective integration of hiPSC-derived Schwann cells into neuromuscular cell culture models, which paves the way for future in vitro studies of NMJ formation and cell-type specific disease mechanisms.

Translation of abstract (German)

Die motorische Innervierung der Skelettmuskulatur geschieht durch neuromuskuläre Synapsen, auch motorische Endplatten genannt. An diesen werden Bewegungsreize von den unteren Motoneuronen an die Muskelfasern übertragen. Um die Entwicklung und Funktion von neuromuskulären Synapsen sowie krankheitsbedingte Mechanismen zu untersuchen, wurden bereits zahlreiche in vitro Modelle entwickelt. Solche Modelle sind bislang aus MotoneuronMuskelzell-Kokulturen aufgebaut, während neuromuskuläre Synapsen in vivo aus weiteren Zelltypen bestehen, insbesondere spezialisierten Gliazellen aus der Familie der SchwannZellen. Obwohl diese an allen der oben genannten Prozesse maßgeblich beteiligt sind, wurden Schwann-Zellen bislang nicht gezielt in neuromuskuläre in vitro Modelle integriert. Ein Hauptgrund hierfür liegt in Limitierungen bei der effizienten Generierung humaner SchwannZellen in vitro. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein optimiertes Protokoll zum Zweck der robusten und effizienten Differenzierung von Schwann-Zellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) etabliert. Die wesentlichen Verbesserungen beruhen auf präziser Aktivierung von BMP-Signaling durch ein Agonist-Antagonist-System, sowie einem definierten Kulturmedium zur Ausreifung, welches auch mit neuromuskulären Kokulturen kompatibel ist. Die so hergestellten Schwann Zellen wurden charakterisiert und in ein Protokoll zur gemeinsamen Kultivierung mit hiPSC Motoneuronen und murinen Muskelzellen integriert. In solchen Kokulturen wurde Kolokalisierung sowohl von Motoneuronen als auch Schwann-Zellen mit Acetylcholinrezeptor-Clustern auf Muskelzellen nachgewiesen, und beide beeinflussten die Ausbildung der Cluster. Darüber hinaus wurden verschiedene Ansätze für multizelluläre und räumlich organisierte neuromuskuläre Kulturen in dreidimensionalen Hydrogelen untersucht. In Summe stellt die vorliegende Arbeit grundlegende Methoden zur selektiven Integrierung von hiPSC-abgeleiteten Schwann-Zellen in neuromuskuläre Zellkulturmodelle bereit, was zukünftige Studien zur Ausbildung von neuromuskulären Synapsen in vitro sowie zu zelltyp spezifischen Krankheitsmechanismen ermöglicht.