German Title: Organoid Assembloids modellieren den Einfluss von Serotonin während der menschlichen kortikalen Entwicklung

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Abstract

The development of the human cortex involves the coordinated interplay between cell proliferation, migration and differentiation. Serotonergic projections from the raphe nuclei were shown to reach the developing cortex at early stages, prior to the main expansion period. Subsequently, serotonin has been linked to several aspects of corticogenesis, including proliferation. However, the lack of appropriate models impedes deepening our understanding of the role of serotonin in human corticogenesis. In this context, human induced stem cell (hiPSC)-derived culture systems became of interest as regionalized brain organoids have been shown to faithfully recapitulate certain aspects of human brain development. In this thesis, hiPSC-derived 2D and 3D model systems were applied to decipher the effect of serotonin on distinct cortical progenitor pools. Thus, apical progenitor cells (aPCs) were identified as recipients of serotonin. Specifically, activation of the serotonergic receptor 5-HT2C was required and sufficient to induce proliferation. Secondly, a mitogenic effect of serotonin was also observed in basal progenitor cells (bPCs), a precursor type fundamental for human brain development, e.g. human-specific cortical expansion. The increased proliferation was here mediated by the receptor 5-HT2A. Interestingly, no change in proliferation behavior was observed in intermediate progenitors (IPs). To closer resemble the interplay between serotonergic neurons and the developing cortex, cortical- raphe assembloids were established. Whereby, a new organoid model was developed mimicking the raphe nuclei. At early time points, raphe organoids (RO) were composed of progenitors exhibiting expression of characteristic markers of serotonergic precursors including NKX2.2 and FOXA2. RO ultimately generated serotonergic neurons marked by TPH2, VMAT2 and serotonin itself. Moreover, by applying the serotonin sensor sDarken the endogenous release of serotonin could be detected. By fusing raphe with cortical organoids (CO) to assembloids, a model system was created representing the influence of serotonergic innervation on human corticogenesis. Specifically, RO-derived serotonergic projections were observed in cortical structures and the utilization of sDarken in CO demonstrated serotonergic innervation. Finally, ventricular zones showed elevated proliferation in the presence of serotonergic projections. Taken together, hiPSC-derived organoids displayed distinct mitogenic effects of exogenous serotonin on different progenitor populations, namely aPCs and bPCs but not IPs. Moreover, the generated assembloid proved valuable by displaying endogenous serotonergic innervation and recapitulating the mitogenic effect of serotonin. Thus, RO-CO assembloids enable further decipherment of the serotonergic role during human corticogenesis and open the possibility to study associated diseases, including autism spectrum disorder.

Translation of abstract (German)

Die Entwicklung des menschlichen Kortex beruht auf die koordinierte Abfolge von Zellproliferation, - wanderung und -differenzierung. Serotonerge Projektionen ausgehend von den Raphe Kerne wurden bereits an frühen Entwicklungsstadien im Kortex nachgewiesen, sogar vor der Hauptexpansionsphase des Kortexes. Folglich wurde Serotonin mit verschiedenen Aspekten der Gehirnentwicklung in Verbindung gebracht, unteranderem mit der Proliferation. Jedoch hat der Mangel an geeigneten humanen Modellen eine tiefere Erforschung der Rolle von Serotonin bis jetzt verhindert. Neue Möglichkeiten schaffen humanen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) und regionalspezifischen Gehirnorganoidmodellen, welche bereits bestimmte Aspekte der menschlichen Gehirnentwicklung replizieren konnten. In dieser Thesis wurde mithilfe von auf hiPSCs-basierenden 2D und 3D Zellkulturmodellsystemen der Effekt von Serotonin auf verschiedene kortikale Progenitorpopulationen untersucht. Apikale Progenitoren (aPCs) wurden als Rezipienten von Serotonin erkannt, wobei diese bei Aktivierung des 5- HT2C eine erhöhte Proliferation zeigten. Ein mitogenischer Effekt von Serotonin konnte ebenso für basale Progenitoren (bPCs) identifiziert werden, welche eine fundamentale Funktion in der humanen kortikalen Expansion haben. Die erhöhte Proliferation beruhte auf der Aktivierung des Rezeptors 5- HT2A. Interessanterweise konnte keine Veränderung des Zellteilungsverhaltens bei intermediären Progenitoren festgestellt werden. Um eine höhere Vergleichbarkeit mit der natürlichen serotonergen Innervierung auf den sich entwickelnden Kortex zu schaffen, wurden Raphe-Kortex Assembloids entwickelt. Dabei wurde ein neues Organoidsystem geschaffen, welches die Raphe Kerne imitiert. An frühen Zeitpunkten exprimierten die Progenitoren des Raphe Organoids (RO) charakteristische Marker von serotonergen Vorläuferzellen wie zum Beispiel NKX2.2 und FOXA2. Schlussendlich generierten RO serotonerge Neurone, welche anhand von TPH2, VMAT2 sowie Serotonin identifiziert wurden. Mithilfe des serotonergen Sensors sDarken konnte sogar die endogene Ausschüttung von Serotonin detektiert werden. Durch die Fusion von Raphe- mit Kortikalen Organoiden zu Assembloids wurde ein Modelsystem geschaffen, welches den Einfluss von Serotonin auf die menschliche Kortikogenese repräsentieren kann. Serotonerge Projektionen des RO konnten in kortikalen Strukturen nachgewiesen werden und der Einsatz von sDarken demonstrierte serotonerge Innervierung. Es konnte außerdem festgestellt werden, dass Ventrikularstrukturen eine erhöhte Proliferation zeigten, wenn serotonerge Ausläufer vorhanden sind. 3 In dieser Arbeit konnte mithilfe von auf hiPSC-basierenden Organoiden definierte mitogenische Effekte auf bestimmte Zellpopulationen, nämlich aPCs and bPCs, aber nicht IPs, identifiziert werden. Der Wert der RO-CO Assembloids konnte durch die serotonerge endogene Innervierung sowie durch die Replizierung des serotonergen mitogenen Effekt bewiesen werden. Dadurch erlauben die Assembloids die weitere Untersuchung der Rolle von Serotonin in der Kortikogenese und öffnet die Möglichkeit assoziierte Erkrankung, wie die Autismus-Spektrum-Störung zu modellieren.