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PDF, English Download (149MB) | Lizenz: A nanoscopic reconstruction of clathrin coat remodeling during mammalian endocytosis by Tschanz, Aline underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0

Abstract

Clathrin-mediated endocytosis is an essential pathway by which eukaryotic cells take up extracellular compounds. It is characterized by the formation of a clathrin coat at the inner leafet of the plasma membrane, which drives the invagination of the membrane to form a spherical vesicle.

While the static ultrastructure and the interactome of the clathrin coat are well-studied, the molecular mechanisms and dynamics of the structural rearrangements that reshape the underlying membrane remain controversial. Convergence toward a detailed mechanistic understanding has been difficult due to the small size, molecular complexity, and relatively fast dynamics of the endocytic process.

In this work, I present a superresolution microscopy approach that allowed me to dynamically reconstruct the 3D architecture of clathrin coats in situ. To robustly determine the geometry of these structures, I employed the model-fitting framework LocMoFit, which approximates each clathrin coat as a spherical cap. The parameters extracted with this approach accurately describe geometric quantities such as coat curvature and surface area and enable the sorting of structures along their endocytic progression. The reconstruction of changes in clathrin coat geometry showed that these structures initially pre-assemble on a flat membrane, initiating curvature once approximately half the final coat area has been accumulated. Curvature then increases while clathrin polymerization continues until the final vesicular coat is formed. Based on these findings, we formulated the cooperative curvature model, which is based on positive feedback for curvature generation. This model accurately describes the experimental data retrieved from three cell lines, thus likely conceptualizing a general, physiologically relevant pathway of membrane bending by the clathrin coat.

Geometric changes in the clathrin coat are a result of the cumulative contributions of over 50 endocytic components involved in this process. Concurrently visualizing multiple components of the endocytic machinery could elucidate the detailed interplay of the involved proteins. As proof of principle, I visualized the dynamic recruitment of dynamin-2 and adaptor protein-2 complex relative to the developing clathrin coat using dual-color imaging. Based on the spatiotemporal distribution of these proteins, their functional role within the larger endocytic machinery could be confirmed.

Taken together, the superresolution microscopy approach I present in this work allows the reliable dynamic reconstruction of clathrin coat remodeling at the nanoscale. The resulting observations informed a new clathrin coat growth model, allowing for further mechanistic insights into the process. Future endeavors will focus on the application of this approach to reconstruct the temporal rearrangement of other components to the endocytic site, progressing towards a structural model of the entire endocytic machinery at the nanoscale. This pipeline further offers a means to test for structural adaptations of the endocytic machinery in response to changing environmental conditions.

Translation of abstract (German)

Die Clathrin-vermittelte Endozytose ist ein essentieller zellulärer Vorgang, über den eukaryotische Zellen extrazelluläre Moleküle aufnehmen können. Der Prozess ist durch die Bildung einer Clathrin-Hülle an der inneren Plasmamembran gekennzeichnet, die eine Einstülpung der Membran und die Bildung eines kugelförmigen Vesikels vermittelt.

Während die statische Ultrastruktur und das Interaktom der Clathrin-Hülle weitreichend bekannt sind, sind die molekularen Mechanismen und die Dynamik der strukturellen Veränderungen, welche die darunter liegende Membran umformen, weitgehend umstritten. Die geringe Größe, molekulare Komplexität, und die Geschwindigkeit der Endozytose erschweren die detaillierte Darstellung dieses zellulären Vorgangs.

In dieser Arbeit stelle ich eine hochauflösende Mikroskopie-Methode vor, die es mir ermöglicht hat, die dynamischen Veränderungen der 3D-Architektur von Clathrin-Hüllen in situ zu rekonstruieren. Um die Geometrie dieser Strukturen robust zu bestimmen, habe ich das Modell-Fitting-Framework LocMoFit verwendet, welches jede Clathrin-Hülle als eine kugelförmige Haube approximiert. Die mit diesem Ansatz extrahierten Parameter beschreiben geometrische Größen wie Radius und Oberfläche des Mantels genau und ermöglichen die Sortierung von Strukturen entsprechend ihrer Einordnung in den Verlauf der Endozytose. Die rekonstruierten Veränderungen in der Geometrie von Clathrin-Hüllen zeigt, dass diese Strukturen sich zu Beginn des Prozesses flach auf der Plasmamembran bilden, um dann Krümmung zu initiieren sobald circa die Hälfte der Oberfläche der finalen vesikulären Hülle bedeckt ist. Die Krümmung der Hülle nimmt danach zu, während Clathrin weiterhin polymerisiert, bis das finale Vesikel gebildet wird. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir das kooperative Krümmungs-Modell formuliert, das auf positivem Feedback zur Erzeugung der Krümmung basiert. Dieses Modell stimmt mit experimentellen Daten von drei verschiedenen Zelllinien überein und beschreibt daher einen allgemeinen, physiologisch relevanten Mechanismus der Membranbiegung durch Clathrin.

Geometrische Veränderungen in der Clathrin-Hülle sind das Ergebnis der kumulierten Beiträge von über 50 an diesem Prozess beteiligten Proteine. Die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Proteine der endozytären Maschinerie könnte deren detailliertes Zusammenspiel aufklären. Um dies zu veranschaulichen, visualisierte ich die dynamische Rekrutierung von Dynamin-2 und dem Adapterprotein 2-Komplex relativ zur Clathrin-Hülle mittels zweifarbiger hochauflösender Mikroskopie. Basierend auf der räumlich-zeitlichen Verteilung dieser Proteine kann ihre funktionelle Rolle innerhalb der größeren endozytären Maschinerie bestätigt werden.

Zusammengefasst ermöglicht die von mir in dieser Arbeit vorgestellte hochauflösende Mikroskopie-Methode die dynamischen Veränderungen der Clathrin-Hülle im Nanometer-Bereich zuverlässig zu rekonstruieren. Die dadurch erzeugten Erkenntnisse ermöglichten es uns, ein neues Wachstumsmodell der Clathrin-Hülle zu formulieren, welches weitere mechanistische Einblicke in den Prozess erlaubt. Zukünftige Bemühungen werden sich auf die Anwendung dieses Ansatzes fokussieren, um die zeitlichen Veränderungen weiterer Proteine innerhalb der endozytischen Maschinerie zu rekonstruieren und so ein strukturelles Modell der gesamten Maschinerie im Nanomaßstab zu erreichen. Diese Methode bietet darüber hinaus die Möglichkeit, strukturelle Anpassungen der endozytischen Maschinerie als Reaktion auf veränderte Bedingungen im Umfeld der Zelle zu testen.