German Title: Charakterisierung der retinalen neurovaskulären Einheit im Zebrafisch

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Abstract

In recent years, zebrafish (Danio rerio) have become an established model to study retinal diseases. Most of the research in zebrafish has focused on vascular and neu-ronal pathologies. However, in many retinal diseases, such as diabetic retinopathy, the entirety of the neurovascular unit, which includes retinal neuronal cells, retinal macro-glia (especially Müller glial cells) and microglia and retinal vascular cells (endothelial cells and vascular mural cells/pericytes), is disrupted. Therefore, this study aimed to analyse whether all components of the neurovascular unit are present in the zebrafish retina and to establish methods which can be used to analyse the neurovascular unit in the zebrafish retina. Those methods were then used to analyse the retinae of pdx1+/- zebrafish mutants, which have gained interest as a potential model for pathologies associated with diabetic retinopathy. The methodical approach to analyse loss of neuronal cells in mammalian retinae could be performed on zebrafish without alterations of the protocol. The retinae of pdx1+/- zebrafish were analysed at three different time points throughout adulthood: 4 months post fertilization (mpf), 12mpf and 20mpf. At 4mpf and 12mpf the overall retinal layer thickness was decreased. However, this change did not persist until 20mpf, which in-dicated that some form of regeneration was taking place in the zebrafish retina, making it difficult to evaluate potential changes. To analyse whether there were signs of regeneration, we performed an antibody stain for PCNA (proliferating cell nuclear antigen), an established marker for proliferation in the zebrafish retina. However, there was no increase in proliferating cells in the retinae of pdx1+/- zebrafish. We found that while in mammals Müller glia only express glial fibrillary acidic protein (GFAP) once they become activated, in zebrafish Müller glia cells always express GFAP. Therefore, to evaluate whether there was increased Müller glial activation, we had to modify the established protocol. Instead of analysing whether Müller glia ex-press GFAP, we counted and compared the number of GFAP-positive cells. In the pdx1+/- retina, we could find no difference between mutants and controls. L-Plastin was used as a marker to identify microglia. There was no increase in L-Plastin positive cells in the retinae of pdx1+/- zebrafish. Previous work has shown angiogenesis in the pdx1+/- retina at 18mpf. To evaluate whether the vascular cells were affected to explain this phenomenon, we adapted the retinal trypsin digest protocol to the zebrafish retina. After identification of the different cell types which are visible in the zebrafish retinal trypsin digest preparation the aver-age number of endothelial cells and vascular mural cells per square millimetre in the adult zebrafish retina were established. However, in comparison to controls, pdx1+/- mutants did not suffer any pericyte or endothelial cell loss. In conclusion, we can show that all components of the neurovascular unit which have been identified in the mammalian retina are present in zebrafish as well. However, at least in the pdx1+/- zebrafish line, they do not seem to interact in a way that would be expected from mammalian models. This indicates that the reaction of the zebrafish retina to hyperglycaemic environmental conditions most likely differs from mechanisms known from mammalian models and needs further investigation. To facilitate future work on the zebrafish retina, this thesis provides detailed and comprehensive protocols to analyse the retinal neurovascular unit in the zebrafish retina.

Translation of abstract (German)

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist in den letzten Jahren ein etabliertes Tiermodell für Netzhauterkrankungen geworden. In einem Großteil der Studien wurde hierbei der Fo-kus auf vaskuläre und neuronale Pathologien gelegt. Bei vielen Netzhauterkrankun-gen, wie beispielsweise der diabetischen Retinopathie, ist allerdings bekannt, dass die gesamte neurovaskuläre Einheit, bestehend aus Neuronen, retinalen Makro- (insbe-sondere Müller Glia) und Mikroglia sowie den Zellen der Blutgefäßwand (Endothelzel-len und Gefäßwandzellen/Perizyten), von den Veränderungen betroffen ist. Diese Dissertation hatte dementsprechend das Ziel herauszufinden, ob alle Zellen der neurovaskulären Einheit auch in der Zebrafisch Retina vorhanden sind, sowie Metho-den zu etablieren, die im Zebrafisch verwendet werden können, um die neurovaskuläre Einheit in der Retina zu analysieren. Diese Methoden wurden danach angewandt, um die Retinae von pdx1+/- Zebrafischmutanten zu analysieren, da diese Mutante in den letzten Jahren als potenzielles Tiermodell für diabetische Retinopathie etabliert wurde. Das Protokoll, das in den Retinae von Säugetieren verwendet wird, um den Verlust von Neuronen darzustellen, konnte ohne Veränderungen für den Zebrafisch übernom-men werden. Es wurden Retinae von pdx1+/- Zebrafisch zu unterschiedlichen Zeitpunk-ten untersucht (4 Monate nach der Fertilisation (mpf = months post fertilisation), 12mpf und 20mpf). Die Dicke der Gesamtretina war sowohl zum Zeitpunkt 4mpf als auch zum Zeitpunkt 12mpf bei pdx1+/- Zebrafischen verringert. Diese Veränderung war zum Zeit-punkt 20mpf nicht mehr nachweisbar, was wiederum dafürspricht, dass dazwischen Regeneration stattgefunden haben muss. Dementsprechend ist es im Zebrafisch schwierig, potenzielle Zeichen der Neurodegeneration abzubilden. Für den Nachweis von proliferierenden Zellen in der Retina wurde der etablierte Mar-ker „proliferating cell nuclear antigen“ (PCNA) verwendet. In der Retina von pdx1+/- Mutanten konnte keine erhöhte Rate an proliferierenden Zellen festgestellt werden. Bei der Analyse der Müller Glia stellten wir fest, dass im Gegensatz zu Säugetieren, deren Müller Glia den Marker „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) nur exprimieren, wenn sie aktiviert sind, die Müller Glia in der Zebrafischretina dauerhaft GFAP expri-mieren. Um dennoch feststellen zu können, ob die Müller Glia in der Zebrafischretina aktiviert waren, modifizierten wir das im Säugetier etablierte Protokoll. Um einen Ver-gleich zwischen den Gruppen zu ermöglichen, zählten wir die GFAP positiven Zellen in den jeweiligen Gruppen. Bei der pdx1+/- Zebrafischlinie konnten wir keinen Unter-schied in der Anzahl der GFAP-positiven Zellen zwischen Mutanten und Kontrollen feststellen. Als Marker für die Identifikation von Mikroglia wurde L-Plastin verwendet. In den Re-tinae von pdx1+/- Zebrafischen waren nicht mehr L-Plastin positive Zellen zu finden als in der Kontrollgruppe. In der Retina von pdx1+/- Zebrafischen wurde bereits nachgewiesen, dass verstärkte Angiogenese ab dem Alter von 18mpf festgestellt werden kann. Um quantifizieren zu können, ob die Zellen der Gefäßwände im Zebrafisch beeinträchtig waren, wurde das Digestionsprotokoll, das in der Säugerretina regelhaft verwendet wird, auf den Zebra-fisch angepasst. Die Endothelzellen und Gefäßwandzellen wurden identifiziert und es wurde ausgewertet, wie viele Endothelzellen und Gefäßwandzellen normalerweise in der adulten Zebrafischretina pro Quadratmillimeter vorkommen. Im Vergleich zur Kon-trollgruppe konnte bei pdx1+/- Zebrafischen kein Endothelzell- oder Gefäßwandzellver-lust nachgewiesen werden. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass alle beteiligten Zellen der neurovaskulären Einheit, die aus der Retina von Säugetieren bekannt sind, auch in der Retina von Zeb-rafischen vorkommen. Allerdings scheint es, als würden sie zumindest in der pdx1+/- Zebrafischlinie nicht so interagieren, wie dies von Experimenten in Säugetieren zu er-warten wäre. Dies ist ein Hinweis, dass die Reaktion der Zebrafischretina auf Umge-bungseinflüsse wie Hyperglykämie eventuell anders ausfällt als dies aus der Retina von Säugetieren bekannt ist. An dieser Stelle ist weitere Forschung von Nöten. Um zukünftige Arbeiten an der Zebrafischretina zu erleichtern, werden mit dieser Disser-tation detaillierte und nachvollziehbare Protokolle zur Verfügung gestellt, um die Kom-ponenten der retinalen neurovaskulären Einheit zu analysieren.