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Abstract

Wnt pathway is one of the main signaling pathways required for development and homeostasis. Wnt proteins must be secreted into the extracellular space in order to trigger the signaling cascade. Regulation of Wnt protein secretion is therefore crucial for Wnt pathway activity. All intracellular membrane trafficking is regulated by Rab GTPases. Very few Rab GTPases, however, have been directly associated with Wnt secretion. I performed a systematic screen by perturbing the 26 Drosophila melanogaster RabGTPases and observing the effects on Wnt secretion in the wing imaginal disc through immunohistochemical analysis. I identified Rab7 as a regulator of Wnt secretion and characterized its role in this process. I found that overexpression of Rab7 induces the accumulation of Drosophila Wnt1 homolog Wingless (Wg) in both secreting and receiving cells, as well as moderate relocalization of Wg from predominantly apical side to the basal side of these cells. The changes in Wg protein localization did not, however, affect the level of secreted Wg in the wing discs or the downstream Wg signaling. By performing colocalization staining, I determined that upon Rab7 overexpression, Wg was localizing to LAMP1- and Arl8-positive lysosomes at the basal side of the wing disc cells. Knockdown of Arl8 in cells with Rab7 overexpression reduced the translocalization of Wg to the basal side of the disc.

In order to study the interaction between Rab GTPases and Wnt secretion in living tissue, I developed novel Drosophila tools, which will be of use to other studies. Firstly, I endogenously tagged the Wg carrier protein Evi/Wls with the fluorescent proteins mScarlet and EGFP. Additionally, I generated a Wg:mScarlet fly line based on the existing Wg:EGFP fly line. Using these tools, I characterized the different fluorescence localization of proteins tagged with EGFP and mScarlet. I confirmed that the fluorescent tags do not affect Wg secretion, but that the difference in signal localization is due to the intrinsic properties of the fluorescent proteins. Secondly, I adapted the LAMA (ligand-modulated antibody fragments) system, an acute protein trap-and-release system previously published in human cell culture, for use in Drosophila. I could show that the system was functional in wing discs and salivary gland cells and that it allowed the trapping of both overexpressed and endogenous GFP-tagged proteins on the mitochondrial membrane and the endoplasmic reticulum (ER). The addition of the release molecule triggered the relocalization of the tagged proteins from the mitochondrial membrane into the cytoplasm. Using the LAMA system, I was able to show that the Wg accumulation induced by Rab7 overexpression appeared within sixty minutes of the Rab7 release. In summary, my data indicate a role of Rab7 in the translocalization of Wg to the basal side through the late endosomal pathway. Furthermore, the development of experimental tools, especially the adaptation of a protein trap-and-release system for use in Drosophila melanogaster, provide a material contribution to the field.

Translation of abstract (German)

Der Wnt Signalweg ist einer der wichtigsten Signalwege während der Entwicklung und Homöostase. Wnt Proteine werden in die extrazelluläre Matrix sekretiert um die Wnt Signalkaskade zu aktivieren. Die Regulierung der Wnt Sekretion ist daher essential für die Aktivierung des Wnt Signalweges. Der gesamte intrazelluläre vesikuläre Transport wird durch Rab GTPasen reguliert. Einige der Rab GTPasen sind direkt mit der Sekretion von Wnt Proteinen assoziiert. In meiner Arbeit habe ich einen systematischen Screen durchgeführt, in dem ich den Einfluss der 26 Drosophila melanogaster Rab GTPasen auf die Wnt Sekretion in der Flügel Imaginal-Scheibe durch Immunohistochemie analysiert habe. Dabei habe ich Rab7 als Kandidat identifiziert und im Folgenden dessen Funktion auf die Wnt Sekretion analysiert. Die Überexpression von Rab7 induziert eine Akkumulation des Drosophila Wnt1 homologen Proteins Wingless (Wg) in Sender- und Empfängerzellen. Desweitern ist eine reilweise Relokalisierung von Wg von der normalerweise apikalen Zellseite zur basalen Seite in diesen Zellen zu beobachten. Diese Veränderung hatte jedoch keinen Effekt auf die Wg Sekretion und auf den Wnt Signalweg in der Empfängerzelle. Desweitern habe ich Färbungen durchgeführt um die Lokalisation von Wg in Zellen mit Überexpression von Rab7 zu bestimmen. Ich konnte zeigen, dass Wg mit den Lysosomen-Markern LAMP1 und Arl8 an der basalen Seite der Flügel Imaginal-Scheiben kolokalisiert. Knock-down von Arl8 in Zellen mit Rab7 Überexpression reduzierte die Lokalisierung von Wg an der basalen Seite der Imaginal-Scheiben Zellen.

Um die Interaktion zwischen Rab GTPasen und der Wnt Sekretion in lebenden Geweben analysieren zu können, habe ich neuartige molekulare Werkzeuge in Drosophila etabliert, die auch in anderen Studien Anwendung finden können. Zuerst habe ich den Wg Rezeptor Evi-Wls mit fluoreszenten Proteinen endogen markiert. Dann habe ich eine fluoreszent markierte Fliegenlinie mit Wg:mScarlet basierend auf der bereits generierten Wg:EGFP Fliege hergestellt. Dadurch konnte ich die Lokalisierungen der fluoreszenz-markierten Fliegen charakterisieren und nachweisen, dass die Sekretion von Wg nicht beeinflusst wird. Eine leicht veränderte Lokalisierung der verschiedenen Fliegenlinien war auf die unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der fluoreszenten Proteine zurückzuführen. Im Folgenden habe ich das LAMA-System für die Anwendung in Drosophila adaptiert. Das System wurde ursprünglich in humaner Zellkultur etabliert, wobei Proteine gezielt in Organellen festgehalten und wieder freigegeben werden. Ich konnte zeigen, dass das LAMA-System in den Flügel Imaginal-Scheiben und in den Speicheldrüsen Zellen funktioniert. Überexprimierte oder endogene GFP-markierte Proteine konnten auf der Mitochondrienmembran sowie im Endoplasmatischen Retikulum (ER) festgehalten werden. Die Zugabe des Freigabe-Moleküls führte erwartungsgemäß zu der Re-Lokalisierung der GFP-markierten Proteine von der Mitochondrienmembran in das Zytoplasma. Anhand des LAMA-Systems konnte ich zeigen, dass der durch die Rab7 Überexpression entstandene Wg Akkumulation innerhalb von sechzig Minuten nach dem Freisetzen von Rab7 hervorgerufen wurde.

Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass Rab7 durch den späten endosomalen Signalweg an der Lokalisierung von Wg zu der basalen Zellseite beteiligt ist. Im Weiteren konnte ich neue molekulare Werkzeuge für Drosophila melanogaster etablieren, im Besonderen das LAMA-System, die einen wichtigen Beitrag für die weitere Forschung leisten können.