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Abstract

The innate immune system is the first wall of defense against many infectious pathogens, such as viruses or bacteria. The antiviral interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) is one of the key players against enveloped viruses like the influenza A virus. IFITM3 is localized in the endosomal-lysosomal system and is known to prevent viral cytoplasmic entry. Different hypotheses on the mode of action of IFITM3 were proposed, but the underlying molecular mechanism still needs to be fully understood. Here, I am using a combination of cryo-light microscopy and in situ cryo-electron tomography to study the antiviral function of IFITM3 within the natural cellular environment in the context of an influenza A virus infection. To visualize the antiviral actions of IFITM3, I established a novel cryo-correlative light and electron microscopy method. This novel approach allowed me to localize trapped influenza A virus particles in the endosomal-lysosomal system of an IFITM3-overexpressing human epithelial lung cell line A549, which allowed me to study them by cryo-electron tomography. Structural analysis of IFITM3-positive multivesicular bodies revealed that IFITM3 does not alter the ultrastructural morphology of the endosomal-lysosomal system and does not modulate the number of intraluminal vesicles (ILVs). These results contradict the ’fusion decoy hypothesis,’ which suggests that an increased number of ILVs in the late endosomal lumen could redirect viral membrane fusion from the limiting late endosomal membrane to fusion with ILVs. High-resolution in situ cryo-electron tomography of influenza A virus particles within late endosomes revealed that IFITM3 traps influenza A virus particles in a hemifusion state at the limiting late endosomal membrane and ILVs. These findings support the previously formulated ’hemifusion stabilization’ hypothesis as they are the first direct proof of IFITM3-mediated hemifusion stabilization within the natural cellular environment. Furthermore, ultrastructural characterization of the hemifusion sites revealed the post-fusion form of the viral fusion protein hemagglutinin (HA). Thus, IFITM3 does not inhibit low-pH triggered HA conformational changes, indicating that IFITM3 inhibits membrane fusion indirectly by modulating the membrane properties of the late endosomal-lysosomal system and thus stabilizing hemifusion.

Translation of abstract (German)

Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen viele infektiöse Krankheitserreger, wie Viren oder Bakterien. Das antivirale Protein ’Interferon induziertes Transmembranprotein 3’ (IFITM3) spielt eine essenzielle Rolle gegen umhüllte Viren wie das Influenza A Virus. IFITM3 befindet sich im endosomalenlysosomalen System der Zelle und verhindert den zytoplasmatischen Eintritt des Virus. Es wurden verschiedene Hypothesen über die Wirkungsweise von IFITM3 aufgestellt, aber der zugrunde liegende molekulare Mechanismus ist immer noch nicht verstanden. In dieser Arbeit nutze ich eine Kombination aus Kryo-Lichtmikroskopie und Kryo-Elektronentomographie, um die antivirale Funktion von IFITM3 innerhalb der natürlichen zellulären Umgebung und im Kontext einer Influenza A Virusinfektion zu untersuchen. Um die antivirale Aktivität von IFITM3 zu visualisieren, habe ich eine neue kryo-korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie Methode entwickelt. Diese Entwicklung ermöglichte es mir, inhibierte Influenza A Viruspartikel im endosomalen-lysosomalen System von IFITM3-überexprimierenden menschlichen Lungenepithelzellen zu lokalisieren. Die Strukturanalyse von IFITM3positiven multivesikulären Körpern ergab, dass IFITM3 die ultrastrukturelle Morphologie des endosomalen-lysosomalen Systems nicht verändert und die Anzahl der intraluminalen Vesikel gleichbleibt. Diese Ergebnisse widersprechen der ’FusionDecoy-Hypothese’, die vermutet, dass eine erhöhte Anzahl von intraluminalen Vesikeln im späten endosomalen Lumen die virale Membranfusion von der endosomalen Membran zur Fusion mit ntraluminalen Vesikeln umleiten könnte. Hochauflösende Kryo-Elektronentomographie von Influenza A Viruspartikeln innerhalb von späten Endosomen zeigte, dass IFITM3 Influenza A Viruspartikel in einem Hemifusionszustand sowohl an der endosomalen Membran als auch an intraluminalen Vesikeln stabilisiert. Diese Ergebnisse liefern den direkten Nachweis, dass IFITM3 die virale Membranfusion von Influenza A Viruspartikeln in einem Hemifusionszustand stabilisiert. Diese Ergebnisse unterstützen die zuvor formulierte ’HemifusionsStabilisierungs’-Hypothese. Darüber hinaus offenbart die ultrastrukturelle Charakterisierung der Hemifusionsstellen die Post-Fusionsform des viralen Fusionsproteins Hämagglutinin. Dies zeigt, dass IFITM3 nicht die übliche Membranfusioninduzierende Rückfaltung von HA2 hemmt, was darauf hindeutet, dass IFITM3 die Membranfusion indirekt hemmt, indem es die Membraneigenschaften des späten endosomalen-lysosomalen Systems moduliert und somit die Hemifusion stabilisiert.