German Title: Aufklärung der Rolle der Transkription bei der Bildung wiederkehrender DNA-Brüche

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Abstract

Mild replication stress in neural stem and progenitor cells leads to the formation of recurrent DNA break clusters (RDC). Genes containing these RDCs (RDC-genes) play important roles in brain functions such as synaptogenesis and cell-cell-adhesion. Most RDC-genes do not harbor break clusters in cell types in which the RDC-genes are not being actively transcribed, but the link between transcription activity and the formation of DNA breaks in RDC-genes has not been investigated before.

To examine whether transcription is the licensing factor for RDC formation, the promoters of two robust RDC-genes, Catenin Alpha 2 (Ctnna2) and Neurexin 1 (Nrxn1), have been independently successfully deleted in multiple ESC-NPC cell lines in vitro. In these cell lines, the transcription of Ctnna2 and Nrxn1 genes was abolished. Moreover, the number of DNA double-strand breaks was reduced in the gene-of-interest while the amount of DNA breaks in other RDC-genes remained unaffected. Additionally, also the replication timing did not change significantly when comparing the cells. Using the same unbiased genome-wide nucleotide resolution assay to detect the recurrent DNA break clusters, I was able to detect the movement of stalled/collapsed replication forks across increasing levels of replication stress and identify the observed breaks as single-ended double-strand breaks. Taking these findings together with transcription and replication directionality, it is evident that there is a bias towards head-on collision (40% more DNA double-strand breaks) versus co-directional collision of the replication fork and transcription machinery. These data fit to the hypothesized transcription/replication conflict, which is believed to play an essential role in the formation of the recurrent DNA break clusters. All things considered, my project illuminates the relationship between transcription, replication, and DNA damage in the form of double strand breaks in replication stress conditions, which can be translated to influences on the developing brain and its genome.

Translation of abstract (German)

Leichter Replikationsstress in neuralen Stamm- und Vorläuferzellen führt zur Bildung wiederkehrender DNA-Bruch-Cluster (RDC). Gene, die diese RDCs enthalten (RDC-Gene), spielen eine wichtige Rolle bei Gehirnfunktionen wie Synaptogenese und Zell-Zell-Adhäsion. Die meisten RDC-Gene beherbergen keine Bruchcluster in Zelltypen, in denen die RDC-Gene nicht aktiv transkribiert werden, aber der Zusammenhang zwischen Transkriptionsaktivität und der Bildung von DNA-Brüchen in RDC-Genen wurde bisher nicht untersucht.

Um zu untersuchen, ob die Transkription der Lizenzfaktor für die RDC-Bildung ist, wurden die Promotoren zweier robuster RDC-Gene, Catenin Alpha 2 (Ctnna2) und Neurexin 1 (Nrxn1), unabhängig voneinander erfolgreich in mehreren ESC-NPC-Zelllinien in vitro deletiert. In diesen Zelllinien wurden die Gene Ctnna2 und Nrxn1 nicht mehr transkribiert. Darüber hinaus wurde die Anzahl der DNA-Doppelstrangbrüche im deaktivierten Gen reduziert, während die Anzahl der DNA-Brüche in anderen RDC-Genen unverändert blieb. Darüber hinaus änderte sich auch der Replikationszeitpunkt beim Vergleich der Zellen nicht wesentlich. Mithilfe der gleichen unverzerrten, genomweiten Nukleotidauflösungsmethode zur Detektion wiederkehrender DNA-Bruchcluster konnte ich die Bewegung blockierter/kollabierter Replikationsgabeln über zunehmende Replikationsstressniveaus hinweg erkennen und die beobachteten Brüche als einseitige Doppelstrangbrüche identifizieren. Betrachtet man diese Ergebnisse zusammen mit der Transkriptions- und Replikationsrichtung, so ist es offensichtlich, dass eine Tendenz zur Frontalkollision (40 % mehr DNA-Doppelstrangbrüche) gegenüber der gleichgerichteten Kollision der Replikationsgabel und der Transkriptionsmaschinerie besteht. Diese Daten passen zum angenommenen Transkriptions-/Replikationskonflikt, der vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Bildung der wiederkehrenden DNA-Bruchcluster spielt. Alles in allem beleuchtet mein Projekt den Zusammenhang zwischen Transkription, Replikation und DNA-Schäden in Form von Doppelstrangbrüchen unter Replikationsstressbedingungen, die sich auf Einflüsse auf das sich entwickelnde Gehirn und sein Genom übertragen lassen.