Preview

PDF, English - main document Download (13MB) | Terms of use

Abstract

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a highly heterogeneous disease with a rather diverse patient outcome. An epigenetic switch between SOX2 and SOX9 has been associated with modulation of cancer cells plasticity. Moreover, numerous studies support an association of altered expression for both transcription factors with the capacity to evade the immune surveillance, to develop treatment resistance and to promote metastasis. However, the molecular mechanisms involved in SOX2/SOX9 regulation and their clinical impact are still largely unknown. Main hypothesis of this study was that the stem cell-related transcription factors SOX2 and SOX9 modulate a gene-regulatory network and thereby influence the treatment response of cancer cells. The aims were to elucidate the role of the SOX2/SOX9 relationship and its heterogeneous expression in tumors, and how this potentially influences the tumor microenvironment including radiotherapy, which finally impacts patient response to therapy. SOX2 and SOX9 expression was investigated in established cancer cell lines, which showed a heterogenous expression pattern for both transcriptional factors. Immunohistochemical staining confirmed a heterogeneous and inverse SOX2/SOX9 expression pattern in most tumor tissues of patients from the Heidelberg Center for Personalized Oncology (HIPO) HNC cohort. Bioinformatics analysis of transcriptome data from The Cancer Genome Atlas for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (TCGA-HNSCC) unraveled candidate genes that might regulate or are the consequence of inverse SOX2/SOX9 expression. Ingenuity Pathway Analysis for selected candidate genes predicted TGF-ß signaling as one of the top canonical pathways related to inverse SOX2/SOX9 expression. The analysis of clinical data from TCGA-HNSCC confirmed that HPV-negative HNSCC with a high SOX2 and low SOX9 expression pattern exhibit an improved overall survival, when radiotherapy is part of the treatment. In line with the clinical data, SOX2 silencing in the OSCC cell line HNO223 reduced their survival capabilities after a single dose as well as fractionated dose of irradiation. A more detailed molecular characterization of established HNSCC cell lines revealed a trend toward reduced SOX2 expression but increased SOX9 protein levels for irradiated cancer cells as compared to controls. An increase of INHBA expression was also evident after irradiation supporting the predicted model of the bioinformatic analysis (positive association between TGF- signaling and a SOX2lowSOX9high phenotype). To investigate whether SOX2 modulates the susceptibility of cancer cells to immune cell attack after irradiation, co-culture assays were established with peripheral blood mononuclear cells that demonstrated the involvement of a more complex network in the regulation of immune effectors. To investigate the putative relation of SOX2/SOX9 expression in tumor cells with the tumor immune milieu in patient samples, single cells dissociated from primary tumors were investigated for marker expression of pan-leukocytes and Natural Killer cells. The analysis revealed an increased occurrence of immune cells in the tumor sample as compared to matched non-malignant adjacent tissue. Immunohistochemistry staining for SOX2 and SOX9 confirmed their heterogenous expression pattern also in those matched pathological samples. Further investigation on the relation between SOX2/SOX9 and the immune milieu for patient tumor material need be performed in order to correlate above findings with the treatment outcome. The recent findings shown that SOX2 and SOX9 predicted a signature gene set which can modulate radioresistance and the TGF-ß signaling is one of the top canonical pathways acting in the overexpression of candidate genes. These results pave the way for a further investigation where these transcription factors could be used as predictive outcome of head and neck squamous cell carcinoma patients.

Translation of abstract (German)

Das Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses (HNSCC) ist eine sehr heterogene Erkrankung mit einem sehr unterschiedlichen Ausgang für die Patienten. Epigenetische Regulationen der Transkriptionsfaktoren SOX2 und SOX9 wurden mit der Modulierung der Plastizität von Krebszellen in Verbindung gebracht. Darüber hinaus belegen zahlreiche Studien einen Zusammenhang zwischen einer veränderten Expression beider Transkriptionsfaktoren und der Fähigkeit, sich der Immunüberwachung zu entziehen, Behandlungsresistenz zu entwickeln und die Metastasierung zu fördern. Die molekularen Mechanismen, die an der Regulierung von SOX2/SOX9 beteiligt sind und ihre klinischen Auswirkungen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Die Haupthypothese dieser Studie war, dass die stammzellverwandten Transkriptionsfaktoren SOX2 und SOX9 ein genregulatorisches Netzwerk modulieren und dadurch die Behandlungsreaktion von Krebszellen beeinflussen. Ziel war es, die Rolle der SOX2/SOX9-Beziehung und ihrer heterogenen Expression in Tumoren aufzuklären und herauszufinden, wie dies möglicherweise die Mikroumgebung des Tumors einschließlich der Strahlentherapie beeinflusst, was sich letztlich auf das Ansprechen der Patienten auf die Therapie auswirkt. Die Expression von SOX2 und SOX9 wurde in etablierten Krebszelllinien untersucht, die ein heterogenes Expressionsmuster für beide Transkriptionsfaktoren aufwiesen. Immunhistochemische Färbungen bestätigten ein heterogenes und inverses SOX2/SOX9-Expressionsmuster in den meisten Tumorgeweben von Patienten aus der HNC-Kohorte des Heidelberger Zentrums für Personalisierte Onkologie (HIPO). Eine bioinformatische Analyse von Transkriptomdaten aus dem The Cancer Genome Atlas for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (TCGA-HNSCC) brachte Kandidatengene ans Licht, die die inverse SOX2/SOX9-Expression regulieren oder deren Folge sein könnten. Die Ingenuity Pathway Analysis für ausgewählte Kandidatengene ergab, dass die TGF-ß-Signalübertragung einer der wichtigsten kanonischen Signalwege ist, die mit der inversen SOX2/SOX9-Expression zusammenhängen. Die Analyse der klinischen Daten von TCGA-HNSCC bestätigte, dass HPV-negative HNSCC mit einem hohen SOX2- und einem niedrigen SOX9- Expressionsmuster ein verbessertes Gesamtüberleben aufweisen, wenn eine Strahlentherapie Teil der Behandlung ist. In Übereinstimmung mit den klinischen Daten verringerte die Ausschaltung von SOX2 in der OSCC-Zelllinie HNO223 deren Überlebensfähigkeit sowohl nach einer einmaligen als auch nach fraktionierter Bestrahlung. Eine detailliertere molekulare Charakterisierung etablierter HNSCC- Zelllinien zeigte einen Trend zu einer reduzierten SOX2-Expression, aber erhöhte SOX9-Proteinspiegel bei bestrahlten Krebszellen im Vergleich zu den Kontrollen. Eine Zunahme der INHBA-Expression war nach der Bestrahlung ebenfalls zu beobachten, was das von der bioinformatischen Analyse vorhergesagte Modell unterstützt (positive Assoziation zwischen TGF-Signalen und einem SOX2-niedrigenSOX9-hohen Phänotyp). Um zu untersuchen, ob SOX2 die Anfälligkeit von Krebszellen für den Angriff von Immunzellen nach der Bestrahlung moduliert, wurden Co-Kulturtests mit mononukleären Zellen aus peripherem Blut durchgeführt, die die Beteiligung eines komplexeren Netzwerks an der Regulierung von Immuneffektoren zeigten. Um den mutmaßlichen Zusammenhang zwischen der SOX2/SOX9-Expression in Tumorzellen und dem Tumorimmunmilieu in Patientenproben zu untersuchen, wurden einzelne, aus Primärtumoren dissoziierte Zellen auf die Expression von Markern von Pan- Leukozyten und natürlichen Killerzellen untersucht. Die Analyse ergab ein erhöhtes Vorkommen von Immunzellen in der Tumorprobe im Vergleich zu abgestimmtem nicht- malignem Nachbargewebe. Die immunhistochemische Färbung für SOX2 und SOX9 bestätigte deren heterogenes Expressionsmuster auch in diesen angepassten pathologischen Proben. Weitere Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen SOX2/SOX9 und dem Immunmilieu des Tumormaterials von Patienten müssen durchgeführt werden, um die oben genannten Ergebnisse mit dem Behandlungsergebnis in Beziehung zu setzen. Die jüngsten Ergebnisse zeigen, dass SOX2 und SOX9 eine Reihe von Signaturgenen vorhersagen, die die Radioresistenz modulieren können und dass der TGF-ß-Signalweg einer der wichtigsten kanonischen Signalwege ist, die bei der Überexpression der Kandidatengene eine Rolle spielen. Diese Ergebnisse ebnen den Weg für weitere Untersuchungen, bei denen diese Transkriptionsfaktoren zur Vorhersage von Ergebnissen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses verwendet werden könnten.