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Abstract

An important function of lipids is their ability to form membrane bilayers. Membrane properties such as thickness, fluidity or curvature depend on the lipid composition, which varies among species, tissues, cells and organelles and even between membrane domains. Membranes are cellular barriers but also provide a matrix for proteins and chemical reactions and their properties can affect protein localizations, and enzyme activities of embedded proteins. Most known glycosylation enzymes are integral membrane proteins, that catalyze glycosylation reactions at the ER and Golgi membranes. With this project, I aimed to study a regulative role of lipids in glycosylation processes. I chose the integral membrane protein Dolichol phosphate mannose synthase (Dpm1) from yeast as a model protein. Dpm1 is an essential protein in eukaryotes, and dysfunction of Dpm1 in vivo leads to hypoglycosylation and severe glycosylation defects. The glycosyltransferase catalyzes the synthesis of the mannosyl donor DolP Man which is required for all protein glycosylation routes. To investigate a role of membrane lipids in modulating the activity of Dpm1, I used a liposomal reconstitution system. I established a purification and liposomal reconstitution protocol and developed an assay to study the enzymatic activity of yeast Dpm1 in vitro. The liposomal lipid composition was then systematically varied, to investigate the effect of the membrane lipids on the enzyme activity of Dpm1. The system was then extended by reconstituting of Dpm1 together with other proteins to study their interaction in different lipid environments. I found that the enzymatic activity of Dpm1 is modulated by the lipid composition of the membrane. An increase in DolP Man formation was observed at increased membrane fluidity and in the presence of phosphatidylethanolamine. In addition, I showed that yeast Dpm2 (Yil102c-A) can stimulate Dpm1 activity, independently of the membrane environment. By including the O mannosyl transferase Pmt4 from yeast or C. thermophilium, I successfully reconstituted O mannosylation in liposomes, where the DolP Man substrate for Pmt4 is provided by the enzymatic activity of Dpm1, demonstrating a successful in vitro reconstitution of a coupled enzyme chain reaction. With this work, I have provided the basis for further studies to investigate the role of lipids in regulating the activity of in vitro reconstituted enzyme reaction chains of glycosylation.

Translation of abstract (German)

Eine wichtige Funktion von Lipiden ist ihre Fähigkeit Membrane zu bilden. Membraneigenschaften wie Dicke, Fluidität oder Krümmung sind abhängig von der Lipidzusammensetzung der Membran, welche sich zwischen Spezies, Gewebearten, Zellen, Organellen und sogar Membrandomänen unterscheidet. Membranen fungieren als zelluläre Barrieren, aber sie bieten auch eine Matrix für Proteine und chemische Reaktionen und ihre Eigenschaften können Proteinlokalisation oder Enzymaktivität von eingebetteten Proteinen beeinflussen. Die meisten heute bekannten Glykosylierungsenzyme sind integrale Membranproteine, welche Glykosylierungen an den ER- und Golgi-Membranen katalysieren. Mit diesem Projekt wollte ich die regulative Rolle von Lipiden in Glykosylierunsprozessen untersuchen. Ich habe das integrale Membranprotein Dolicholphosphat-Mannose-Synthase (Dpm1) aus Hefe als Modelprotein ausgewählt. Dpm1 ist ein essentielles Protein in Eukaryoten, und gestörte Funktion von Dpm1 in vivo führt zu Hypoglykosylierung und schweren Glykosylierungsdefekten. Die Glycosyltransferase katalysiert die Synthese von dem Mannosyldonor DolP Man, welcher für alle Proteinglykosylierungswege benötigt wird. Um die Rolle von Membranlipiden für die Aktivität von Dpm1 zu untersuchen habe ich ein Aufreinigungsprotokoll und Liposom-basiertes Rekonstitutionsprotokoll etabliert und einen Test entwickelt um die enzymatische Aktivität von Hefe Dpm1 in vitro zu untersuchen. Die Lipidzusammensetzung der Liposomen wurde systematisch verändert um den Effekt der Membranlipide auf die Enzymaktivität zu untersuchen. Das System wurde zusätzlich erweitert durch die Rekonstitution von Dpm1 zusammen mit weiteren Proteinen. Ich konnte zeigen, dass die Aktivität von Dpm1 durch die Lipidzusammensetzung beeinflusst wird. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass Dpm2 aus Hefe (Yil102c-A) die Aktivität von Dpm1 unabhängig von der Membranzusammensetzung stimuliert. Durch die Hinzunahme der O Mannosyltransferase Pmt4 aus Hefe oder C. thermophilium konnte ich erfolgreich eine gekoppelte enzymatische Reaktionskette in Liposomen in vitro rekonstituieren, bei welcher das DolP Man Substrat für Pmt4 durch die enzymatische Reaktion von Dpm1 gebildet wird. Mit dieser Arbeit habe ich eine Basis gelegt, um die Rolle von Lipiden in der Regulation von Enzymaktivität von in vitro rekonstituierten Glykosylierungskettenreaktionen zu untersuchen.