German Title: Die Evolution zellulärer funktioneller Module und der Ursprung koordinierten Verhaltens in Metazoa.

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Abstract

Proteins are essential components of life. Their functions rely on intrinsic activities and specific interactions which together constitute the functional identity of a cell. Within this network of interactions, proteins (and other macromolecules) form dense and functional discernable modules that exert new, module-specific functions and are referred to here as cellular functional modules (CFMs). Examples of CFMs are protein complexes and regulatory or metabolic pathways. CFMs are evolutionary traceable, heritable and able to duplicate and diversify, and thus can be regarded independent units of selection. This opens up new avenues towards solving challenging questions in evolutionary biology, such as the origin of complex cellular traits. In particular, the nervous and muscular systems are essential for the evolution of coordinated behavior in animals, yet their origin remains obscure. This thesis summarizes my efforts investigating the evolution of CFMs, with a focus on actomyosin CFMs, using the freshwater sponge Spongilla lacustris as a model species. Sponges (Porifera) are one of the earliest-branching animals, lacking “conventional” neurons and muscle cell types, yet are shown to express neuronal and actomyosin CFMs. Strikingly, external stimuli evoke an intriguing coordinated whole-body movement which remains poorly understood. To advance on this, (1) I improved the annotation of the S. lacustris proteome by ~50%, designing a custom pipeline for protein structure-based functional transfer, termed MorF (Morpholog Finder), in a collaborative effort. This work confirmed that morphologs (= structural similar proteins) are homologs in most cases and share functions even when homology is no longer detectable with conventional sequence-based methods. Novel annotations revealed new cell-type specific CFMs. Leveraging this, (2) I specifically focused on shape changes and molecular mechanisms of the whole-body movement using live 3D imaging, pharmacological profiling, and a survey of sponge cell-type specific expression of actomyosin CFMs. I found that - in contrast to prevailing views - the movement is triggered by the relaxation of epithelial actomyosin stress fibers via an Akt/NOS/PKG pathway, conserved in vertebrate smooth musculature. These stress fibers likely present an early form of an actomyosin CFM that was ultimately incorporated into specialized myocytes. Functional proteomic profiling of the movement (3), in particular Thermal Proteome Profiling, quantitative phosphoproteomics and secretomics, reaffirmed the “smooth-muscle”-like regulation and further suggested a mechanosensory function of the stress fibers, serving both as “sensor” and “actor”. The secretion of paracrine and diffusible signals sheds new light on the whole-body coordination in an otherwise nerve-less animal. During the movement induced by mechanical stimulation, the sponge activated an inflammation-like state. This “relaxant-inflammatory” CFM represents a conserved reaction of fluid-carrying metazoan systems - such as the vertebrate vascular system - to oscillatory shear stress. Last, (4) I outline my efforts towards a sponge-specific protein-protein interactome, using Co-fractionation mass spectrometry and single cell RNAseq co-regulation, presenting preliminary sponge complex CFMs. Together, the evolutionary origin and diversification of the relaxant-inflammatory CFM in animal movement is a prime example how complex cellular functions can emerge through the step-wise integration of existing CFMs.

Translation of abstract (German)

Proteine sind zentrale Bausteine des Lebens. Ihre Funktionen beruhen auf intrinsischen Aktivitäten und spezifischen Interaktionen, die als Gesamtheit die funktionelle Identität einer Zelle bilden. Innerhalb dieses Interaktionsnetzwerkes bilden Gruppen von Proteinen (und anderen Makromolekülen) eng interagierende und funktionell differenzierte Module, die neue, modulspezifische Funktionen ausüben und in dieser Arbeit als zelluläre funktionelle Module (CFMs) bezeichnet werden. Beispiele für CFMs sind Proteinkomplexe, regulatorische Interaktionen oder Stoffwechselwege. CFMs sind evolutionär verfolgbar, vererbbar, duplizierbar und diversifizierbar und können somit als unabhängige Selektionseinheit betrachtet werden. Diese Sichtweise eröffnet neue Wege zur Lösung unbeantworteter Fragen der Evolutionsbiologie, wie z. B. dem Ursprung komplexer zellulärer Merkmale. Insbesondere das Nerven- und das Muskelsystem sind für die Evolution koordinierten Verhaltens bei Tieren von entscheidender Bedeutung, ihr Ursprung ist jedoch nach wie vor ungeklärt. Diese Arbeit befasst sich mit der Evolution von CFMs, insbesondere mit Schwerpunkt auf Aktomyosin CFMs. Dafür wurde der Süßwasserschwamm Spongilla lacustris als Modellorganismus ausgewählt. Schwämme (Porifera) bilden einen Tierstamm, der sich früh in der Evolution der Tiere abgespalten hat. Schwämme besitzen keine “konventionellen” Neuronen und Muskelzelltypen, aber exprimieren nachweislich neuronale und Aktomyosin CFMs. Bemerkenswerterweise kann durch verschiedene äußere Reize eine koordinierte Bewegung des gesamten Körpers hervorrufen werden, die bisher wenig erforscht ist. Um diese Frage weiter zu verfolgen, habe ich (1) die Annotation des Proteoms von S. lacustris um etwa 50 % gesteigert, indem ich - als Kollaborationsprojekt - eine maßgeschneiderte Pipeline für den strukturbasierten Funktionstransfer von Proteinen entwickelt habe, die MorF (Morpholog Finder) genannt wird. Diese Arbeit bestätigte, dass Morphologe (= strukturell ähnliche Proteine) in den meisten Fällen Homologe sind und eine identische Funktion besitzen, selbst wenn Homologie mit herkömmlichen, sequenzbasierten Methoden nicht mehr nachweisbar ist. Mit den neuen Proteinannotationen konnten zusätzliche zelltypspezifische CFMs ermittelt werden. Auf dieser Grundlage (2) fokusierte ich mich speziell auf die morphologischen Änderungen und molekulare Mechanismen der Ganzkörper-Bewegung. 3D-Mikroskopie von lebenden Schwämmen, pharmakologische Untersuchungen und ein Überblick zellspezifischen Expression von Aktomyosin CFMs zeigte, dass die Bewegung - im Gegensatz zur vorherrschenden Meinung - durch Entspannung epithelialer Aktomyosin-Stressfasern ausgelöst wird. Es zeigte sich, dass dies über einen Akt/NOS/PKG-Weg kontrolliert wird, der in der glatten Muskulatur von Wirbeltieren konserviert ist. Diese Stressfasern stellen wahrscheinlich eine frühe Form eines Aktomyosin CFM dar, welches letztendlich in spezialisierten Myozyten übernommen wurde. Die Charakterisierung der Bewegung durch Funktionelle Proteomik, besonders durch “Thermal Proteome Profiling”, quantitative Phosphoproteomik und Sekretomik, bestätigten die Ähnlichkeit der Regulation zu der von glatter Mukulatur und legten zusätzlich eine mechanosensorische Funktion der Stressfasern nahe, die äußere Einflüsse fühlen und gleichzeitig entsprechend agieren können. Die Sekretion von parakrinen und diffusionsfähigen Signalen wirft ein neues Licht auf die Koordination von Bewegungen in einem Tier ohne Nervensystem. Zusätzlich konnte ich einen entzündungsähnlichen Zustand des Schwammes detektieren, der mit einer Bewegung einherging, die durch mechanische Reize ausgelöst wurde. Dieses “relaxantinflammatory” (“entspannend-entzündliche”) CFM stellt eine konservierte Reaktion von flüssigkeitstransportierenden Systemen in Metazoen (z.B. dem Gefäßsystem von Wirbeltieren) als Anwort auf oszillierende Scherspannung dar. Zuletzt (4) skizziere ich meinen Fortschritt ein schwammspezifisches Protein-Protein-Interaktom mit Hilfe von Co-Fraktionierungs- Massenspektrometrie und Koregulation von Genexpression in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten zu generieren. Insgesamt ist die evolutionäre Entstehung und Diversifizierung des “relaxantinflammatory” CFM ein Paradebeispiel dafür, wie komplexe zelluläre Funktionen durch die schrittweise Integration bestehender CFMs entstehen können.