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Abstract

Die Glykosylierung ist eine wichtige co- und posttranslationale Modifikation von Proteinen, die für deren korrekte Faltung, Funktionalität und Interaktionen benötigt wird. Wird dieser Prozess durch Mutationen im Gen eines der beteiligten Proteine beeinträchtigt, führt dies zu einer seltenen Stoffwechselkrankheit, die als „Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG) bezeichnet wird. Der sehr seltene CDG-Typ SLC35A1-CDG wird durch einen Defekt des SLC35A1-Proteins hervorgerufen, das als Sialinsäuretransporter dafür verantwortlich ist, CMP-Sialinsäure vom Cytosol ins Golgi-Lumen zu transportieren. Bisher waren nur fünf SLC35A1-CDG Patienten bekannt, die Symptome wie neurologische Defizite und Gerinnungsstörungen aufwiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die c.133A>G (p.Thr45Ala) Mutation im SLC35A1 Gen einer weiteren Patientin charakterisiert, die unter anderem an einer allgemeinen Gedeihstörung, Mikrozephalie, Thrombozytopenie sowie Neutropenie leidet. Anhand einer in silico Analyse wurde zunächst ermittelt, dass die Mutation pathogene Eigenschaften, aber möglicherweise eher milde Auswirkungen auf die Funktionalität des Proteins haben könnte. Um die Mutation unabhängig vom genetischen Hintergrund der Patientin zu untersuchen, wurde eine HEK293 SLC35A1 Knock-out-Zelllinie mittels CRISPR/Cas9 generiert, durch die festgestellt werden konnte, dass das mutierte SLC35A1-Protein generell noch funktionsfähig war, aber eine verkürzte Halbwertszeit aufwies. In Fibroblasten lokalisierte es ordnungsgemäß im Golgi-Apparat, aber zeigte eine leicht reduzierte Aktivität, die möglicherweise auf die verringerte Stabilität zurückzuführen war. In den Fibroblasten der Patientin wurde neben einer leichten Störung der O-Glykosylierung eine stark beeinträchtigte N-Glykosylierung sowie eine reduzierte α-2,3 Sialylierung festgestellt. Im Serum der Patientin waren dagegen kaum Glykosylierungsdefizite vorhanden, was auf organspezifische Unterschiede in der Bereitstellung von Sialinsäure für die Glykosylierungsprozesse hindeuten könnte. Durch transkriptomische und proteomische Analysen wurden Beeinträchtigungen weiterer Glykosylierungsprozesse, der O-GlcNAcylierung und C-Mannosylierung, in den Patientenfibroblasten entdeckt, sowie die Deregulation verschiedener Bereiche der N-Glykosylierung, die teilweise in direktem Zusammenhang mit einem SLC35A1-Defekt zu stehen scheinen. Auch die Lipidhomöostase war in den Zellen der Patientin verändert und es gab Hinweise auf eine Beeinträchtigung von grundlegenden zellulären Funktionen sowie dem Energiemetabolismus. Die beobachtete, verminderte Proliferation der Patientenfibroblasten konnte durch Supplementation mit GlcNAc verbessert werden, nicht jedoch die Glykosylierungsdefizienz, weshalb dieser Phänotyp vermutlich auf Probleme im Metabolismus zurückzuführen war. Ein Komplementierungsversuch der Patientenzellen mit dem wildtypischen SLC35A1-Gen konnte den Glykosylierungsdefekt nur teilweise beheben, weshalb auch der individuelle genetische Hintergrund der Patientin zu den beobachteten Defiziten beitragen könnte. Letztendlich scheint die SLC35A1 c.133A>G Mutation zu einer eher milden Form von SLC35A1-CDG zu führen, die vermutlich hauptsächlich auf die reduzierte Stabilität des mutierten Proteins zurückzuführen ist.

Translation of abstract (English)

Glycosylation is an important co- and post-translational modification of proteins which is required for various of their properties, like the correct folding, functionality and interactions. If this process is impaired due to mutations in the genes involved, this leads to a rare metabolic disease called “Congenital Disorders of Glycosylation” (CDG). A very rare type of CDG, SLC35A1-CDG, is caused by a defective SLC35A1 protein, a sialic acid transporter responsible for translocation of CMP-sialic acid from the cytosol into the Golgi-Lumen. To date, only five SLC35A1-CDG patients had been known. They were described to have symptoms such as neurological deficits and coagulation disorders. In this thesis, the c.133A>G (p.Thr45Ala) mutation in the SLC35A1 gene of new patient was characterized, who suffers from general failure to thrive, microcephaly, thrombocytopenia and neutropenia, among other symptoms. First, an in silico analysis was performed which proposed that the mutation could have pathogenic properties, but might only mildly affect the functionality of the protein. To investigate the mutation independently of the patient’s genetic background, a CRISPR/Cas9 mediated SLC35A1 Knock-out cell line was generated using HEK293 cells. By this cell line, it was determined that the mutated SLC35A1 protein was still functional but had a shortened half-life. In fibroblasts, the mutated SLC35A1 localized properly in the Golgi apparatus but showed a slightly reduced activity, possibly due to the decreased stability. The patient’s fibroblasts showed a severely impaired N-glycosylation and reduced α-2,3 sialylation in addition to a slightly affected O-glycosylation. In contrast, almost no glycosylation deficits could be observed in the patient’s serum which might indicate organ specific differences in the provision of sialic acid for glycosylation purposes. A transcriptomic and proteomic analysis in the patient’s fibroblasts revealed a deregulation of the additional glycosylation processes O-GlcNAcylation and C-mannosylation as well as multiple dysregulations of genes involved in the N-glycosylation process, which might to some extent be directly linked to a SLC35A1 defect. Additionally, the lipid homeostasis was altered in the patient’s cells as well and there was evidence of an impairment of basic cellular functions and the energy metabolism. The observed reduced proliferation of the patient’s fibroblasts but not the glycosylation deficit could be increased by supplementation of the cells with GlcNAc, which is why this phenotype was probably due to metabolic impairments. Complementation of the patient’s fibroblasts with the wild-type SLC35A1 could only partially rescue the glycosylation defect. Therefore, the patient’s individual genetic background may play a role in terms of the observed deficits. Finally, the SLC35A1 c.133A>G mutation seems to cause a rather mild form of SLC35A1-CDG, probably mainly due to the reduced stability of the mutant protein.