German Title: Die Rolle von Phasentrennung in Centrin Interaktionen während der Plasmodium falciparum Schizogony.

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Abstract

Extensive proliferation of the malaria-causing parasite Plasmodium falciparum inside red blood cells is essential for its pathogenesis and survival strategy. Here Plasmodium spp. proliferate asexually via schizogony, an atypical form of cell division, wherein the parasite undergoes multiple rounds of asynchronous nuclear division in a shared cytoplasm. The Plasmodium centrosome, the centriolar plaque, is a critical regulator in this process that nucleates mitotic spindle microtubules and limits proliferation as it needs to duplicate before each nuclear division. However, little is known about the molecular and physiochemical composition of this protein-dense and amorphous organelle.

Within this thesis, I investigated the localization, dynamics, and biochemical interactions of the four Plasmodium centrins, PfCen1-4, a family of highly conserved centrosomal proteins. I demonstrated that all four localize to the centriolar plaque at the onset schizogony and defined a coordinated disassembly event during its final stages. To study their localization in more detail, I adapted live-cell Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) to Plasmodium for the first time, which revealed a highly dynamic rearrangement of PfCen1-Halo within the centriolar plaque. Investigating the underlying interactions of the Ca2+-binding centrins via microscopy-assisted in vitro assays revealed that specifically PfCen1 and PfCen3 can undergo Ca2+-dependent liquid-liquid phase separation, individually or as joint condensates. By testing a phylogenetically diverse panel of eukaryotic centrins, including human centrin 2, I further demonstrated that phase separation capability is an evolutionarily conserved feature. In vitro mutagenesis revealed a critical dependence on the N-terminus, wherein the presence of an intrinsically disordered region is predictive of phase separation capability. As the protein density and absence of structural features within the centriolar plaque could be well explained by it being a proteinaceous liquid, I investigated whether centrin dynamics and localization might be driven by phase separation in vivo. As one of the defining features of phase separation is its dependency on a critical concentration, I developed pFIO, a new DiCre/loxP based inducible overexpression system for P. falciparum. This allowed me to exert better control over intracellular PfCen1 levels, where increasing concentration correlated with formation of artificial non-centrosomal assemblies and premature recruitment to the centriolar plaque. Loss of Ca2+-binding capability also abolished both in vitro phase separation and in vivo assembly. However, machine-learning assisted analysis of PfCen1 distribution in a large dataset of live cells revealed an inconsistent cellular concentration during assembly, arguing against a concentration threshold as a key trigger for localization. Centrosomal and artificial PfCen1-GFP assemblies also showed little turnover, suggesting a more solid state, but could still be dissolved and had no affinity to aggregate stains. This might point towards a gradual hardening process.

This work represents the first study of liquid-liquid phase separation in Plasmodium and pioneered useful toolsets for its subsequent research. It further provides important context for future studies on centrins across the eukaryotic spectrum and has potential implications for the material state and assembly mechanism of the centriolar plaque.

Translation of abstract (German)

Die beträchtliche Vermehrung des Malariaerregers Plasmodium falciparum in roten Blutkörperchen ist von entscheidender Bedeutung für seine Pathogenese und Überlebensstrategie. Hier vermehren sich Plasmodium Spezies asexuell durch Schizogonie, eine untypische Form der Zellteilung, bei welcher der Parasite mehrere Runden asynchroner Kernteilung in einem gemeinsamen Zytoplasma durchläuft. Das Zentrosom von Plasmodium, die zentrioläre Plaque, ist ein entscheidender Regulator in diesem Prozess, welcher Mikrotubuli der mitotischen Spindel nukleiert und die Proliferation limitiert, da sie sich vor jeder Kernteilung verdoppeln muss. Über die molekulare und physiochemische Zusammensetzung dieses proteindichten und amorphen Organells ist jedoch nur wenig bekannt.

Im Rahmen dieser Dissertation untersuchte ich die Lokalisierung, Dynamik, und biochemischen Wechselwirkungen der vier Plasmodium Centrine, PfCen1-4, einer Familie hochgradig konservierten zentrosomaler Proteine. Ich demonstrierte, dass alle vier zu Beginn der Schizogonie an der zentriolären Plaque lokalisieren und definierte ein koordiniertes Disassemblierungs Event in der Endphase. Um ihre Lokalisierung genauer zu untersuchen habe ich zum ersten Mal Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) für lebende Zellen in Plasmodium adaptiert, was eine hochdynamische Umstrukturierung von PfCen1-Halo innerhalb der zentriolären Plaque aufdeckte. Die Untersuchung der zugrundeliegenden Interaktionen der Ca2+-bindenden Centrine mittels Mikroskopie-gestützter in vitro Tests ergab, dass spezifisch PfCen1 und PfCen3 eine Ca2+-abhängige flüssig-flüssig Entmischung durchlaufen können, einzeln oder als gemeinsame Kondensate. Anhand einer phylogenetisch vielfältigen Auswahl eukaryotischer Centrine, einschließlich von humanem Centrin 2, zeigte ich außerdem, dass die Fähigkeit zur Entmischung ein evolutionär konserviertes Merkmal ist. In vitro Mutagenese ergab eine kritische Abhängigkeit vom N-Terminus, wobei das Vorhandensein einer intrinsisch ungeordneten Region mit der Fähigkeit zur Entmischung korreliert. Da die Proteindichte und Abwesenheit von Strukturen innerhalb der zentriolären Plaque sich gut dadurch erklären ließen, dass es sich um eine proteinöse Flüssigkeit handelt, untersuchte ich, ob die Centrin Dynamik und Lokalisation in vivo durch Entmischung getrieben sein könnte. Da eines der entscheidenden Merkmale von Entmischung ihre Abhängigkeit von einer kritischen Konzentration ist, entwickelte ich pFIO, ein neues DiCre/loxP-basiertes, induzierbares Überexpressionssystem für P. falciparum. Dies ermöglichte mir eine bessere Kontrolle über die intrazellulären PfCen1-Level, wobei steigende Konzentration mit der Bildung artifizieller, nicht-zentrosomaler Verbindungen und einer verfrühten Rekrutierung an die zentrioläre Plaque korrelierte. Verlust der Ca2+-Bindungsfähigkeit verhinderte sowohl in vitro Entmischung wie auch in vivo Assemblierung. Eine durch maschinelles Lernen unterstütze Analyse der PfCen1 Verteilung in einem großen Datensatz lebender Zellen zeigte jedoch eine inkonsistente zelluläre Konzentration während der Assemblierung, was gegen eine Konzentrationsschwelle als zentraler Auslöser für Lokalisierung spricht. Zentrosomale und artifizielle PfCen1-GFP Verbindungen zeigten ebenfalls einen geringen Austausch mit der Umgebung, was auf einen solideren Zustand hindeutet, konnten jedoch aufgelöst werden und hatten keine Affinität zu Aggregat-Färbemitteln. Dies könnte auf einen graduellen Verhärtungsprozess hindeuten.

Diese Arbeit ist die erste Studie von flüssig-flüssig-Entmischung in Plasmodium und kreierte nützliche Instrumente für die weitere Erforschung. Darüber hinaus schafft sie wichtigen Kontext für künftige Centrin Studien im gesamten eukaryotischen Spektrum und hat potenzielle Implikationen für den Materialzustand und Assemblierungs-Mechanismus der zentriolären Plaque.