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Abstract

Human papillomavirus (HPV) is the most common sexually transmitted infectious agent in humans. Infections are often asymptomatic and resolve spontaneously, but a subset of persisting infections can develop into warts, precancers, and eventually cancers in women and men. The so-called high-risk HPV (hrHPV) types are a major cause of cancer responsible for ~4.5 % of all annual cancer cases worldwide. Among hrHPVs, HPV16 is the most prevalent type and causes ~60 % of invasive cervical cancer and ~85 % of all other HPV-associated cancers. The primary oncoproteins of HPV16, E6 and E7, represent ideal targets for immunotherapy as they drive the malignant transformation of infected cells, are constitutively expressed, and are immunologically foreign. However, the development of a therapeutic vaccine has proven to be challenging, likely due to the low immunogenicity of persistent HPV16 infections. A vaccine must be highly immunogenic and elicit a strong antigen-specific cytotoxic response. To identify the most potent epitopes for immunotherapies, the research group set the aim of establishing an epitome map for the HPV16 oncoproteins E6 and E7 that specifies truly human leucocyte antigen (HLA)-presented and immunogenic epitopes. A major part of this effort is the detection of HLA-presented peptides on the surface of naturally HPV16-transformed cell lines by immunopeptidomics. In this thesis, I developed a targeted immunopeptidomics workflow for the sensitive and highly specific detection of HLA class I-presented peptides. To this end, I developed effective quality control measures for the wet-lab technique and implemented chemical modification steps for peptide oxidation and alkylation that allow for optimal detection of the chemically diverse peptides. I optimized the liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) acquisition of the peptides so that each target could be acquired with high sensitivity. In part, this was achieved by optimizing the LC gradient and tuning the scheduling of the MS acquisition in a manner that minimizes sensitivity-limiting parallel acquisition. Additionally, I showed that tuning the MS acquisition parameters enhances the sensitivity of peptide detection in complex samples. I characterized all targets in detail to allow for effective fine-tuning on a per-peptide basis. This included a newly developed approach for optimization of collision energies on a per-precursor basis, which I found to be especially effective for immunopeptidomics. The resulting method is scalable for targeting of hundreds of peptides, while allowing for maximum sensitivity where extra validation is required. I applied the established method for the immunopeptidomics part of epitome map project. This involved the analysis of 20 cell lines covering six selected HLA supertypes (A01, A02, A03_A11, A24, B07 and B15), which are groups of HLA allotypes that bind similar peptides. Altogether, 239 distinct peptides were targeted. The HLA-restrictions of all peptide detections were validated through the complementary use of a newly developed untargeted immunopeptidomics analysis. This enabled me to detect the presentation of 25 HPV16-derived peptides on naturally HPV-transformed cell lines, 23 of which had not been MS-detected before. The associated HLA-restrictions cover all six of the targeted HLA supertypes, which I confirmed to allow for a robust and extensive predicted vaccine population coverage of more than 99 %. These data complete the immunopeptidomics part of the HPV16 E6 and E7 epitome map. Ongoing experiments of the complementary immunogenicity assessment functionally characterize the peptides regarding their immunogenicity, immunodominance and frequency of memory responses in peripheral blood mononuclear cells from healthy donors. The most promising epitopes, as informed by these combined efforts, will be tested for their capability to induce specific killing of HPV-transformed cells. Taken together, this will inform the selection of epitopes for inclusion in epitope-specific vaccine formulations for future clinical trials. Ultimately, the presented findings will contribute significantly to the rational design of a therapeutic HPV16 vaccine applicable for a large part of the population.

Translation of abstract (German)

Das Humane Papillomvirus (HPV) ist das am häufigsten sexuell übertragene menschliche Pathogen. Die Infektionen verlaufen häufig asymptomatisch und heilen spontan ab, während eine Minderheit der Infektionen persistiert und zu Gewebetransformationen mit Bildung von Genitalwarzen, Präkanzerosen und letztendlich Karzinomen in Frauen und Männern führen kann. Die so genannten Hochrisiko-HPV-Typen (hrHPV) sind ein häufiger Grund für die Entwicklung von Karzinomen und sind verantwortlich für ca. 4,5 % der gesamten jährlichen Karzinominzidenz weltweit. Unter den hrHPV hat HPV16 die größte Prävalenz und verursacht ca. 60 % der invasiven Zervixkarzinome und ca. 85 % aller anderen HPV-assoziierten Karzinome. Die primären Onkoproteine von HPV16, E6 und E7, sind ein ideales Ziel für Immuntherapien, da sie die maligne Transformation der infizierten Zellen vorantreiben, konstitutiv exprimiert werden und immunologisch fremd sind. Trotzdem hat sich die Entwicklung eines therapeutischen Vakzins als schwierig erwiesen, wahrscheinlich aufgrund der geringen Immunogenität von persistierenden HPV16 Infektionen. Zu den Grundvoraussetzungen eines wirksamen therapeutischen Vakzins gehören eine hohe Immunogenität und das Auslösen einer starken zytotoxischen Immunantwort. Um die idealen Epitope für zukünftige Immuntherapien zu identifizieren, hat sich die Forschungsgruppe zum Ziel gesetzt eine Kartierung der Epitope der HPV16 Onkoproteine E6 und E7 vorzunehmen, welche alle tatsächlich humanes Leukozytenantigen (HLA)-präsentierten und immunogenen Epitope abbildet. Ein wichtiger Teil dieses Vorhabens ist die Detektion von HLA-präsentierten Peptiden auf den Oberflächen von natürlich HPV16 transformierten Zelllinien mit den Methoden der Immunpeptidomforschung (Immunopeptidomics). In dieser Arbeit habe ich ein Protokoll für zielgerichtete Immunopeptidomics zur sensitiven und hochspezifischen Detektion von HLA Klasse I-präsentierten Peptiden entwickelt. Hierzu habe ich effektive Qualitätssicherungsmaßnahmen für die Wet-lab Methodik entwickelt und chemische Modifikationen der Peptide durch Oxidation und Alkylierung implementiert, welche eine optimale Detektion der chemisch diversen Peptide erlaubt. Ich habe die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Akquisition der Peptide so optimiert, dass jedes Zielpeptid mit einer hohen Sensitivität erkannt werden kann. Ein Teil dieser Entwicklung war die Optimierung des LC Gradienten und die Anpassung der zeitlichen Parameter der MS-Akquisition, sodass sensitivitätslimitierende parallele Akquisition von Peptiden minimiert wurde. Darüber hinauszeigte ich, dass eine Anpassung der MS-Akquisitionsparameter zur Verbesserung der Detektionssensitivität von Peptiden in komplexen Proben führt. Ich habe alle Zielpeptide charakterisiert, um eine effektive Optimierung der Methodik für jedes einzelne Peptid zu ermöglichen. Hierbei habe ich einen neuen Ansatz für die Optimierung der Kollisionsenergien für die einzelnen Präkursoren entwickelt, und festgestellt, dass dies besonders für Immunopeptidomics vorteilhaft ist. Die entwickelte Methode ist skalierbar für die Untersuchung von hunderten Peptiden und ermöglicht gleichzeitig eine maximale Sensitivität, wo eine zusätzliche Validierung von Peptiden notwendig ist. Ich habe die entwickelte Methode für den Immunopeptidomics-Teil des Epitomkartierungsprojektes eingesetzt. Hierzu wurden 20 Zelllinien, die sechs ausgewählte HLA-Supertypen (A01, A02, A03_11, A24, B07 und B15) abdecken, untersucht. HLA-Supertypen sind Gruppen von HLA-Allotypen, die ähnliche Peptide binden können. Insgesamt wurden 239 verschiedene Peptide gezielt gesucht. Die HLA-Restriktion aller detektierten Peptide wurde durch eine ergänzende neu entwickelte nicht-zielgerichtete Immunopeptidomics validiert. Es gelang der Nachweis der Präsentation von 25 aus HPV16 stammenden Peptiden auf natürlich HPV-transformierten Zelllinien, von denen 23 Peptide bisher noch nicht mittels MS detektiert worden waren. Die assoziierten HLA-Restriktionen decken alle sechs der anvisierten HLA-Supertypen ab, was eine robuste und umfassende Populationsabdeckung eines entsprechenden Vakzins von über 99 % erwarten lässt. Diese Daten komplettieren den Immunopeptidomics-Teil der Kartierung des HPV16 E6 und E7 Epitoms. In parallel laufenden Experimenten zur Beurteilung der Immunogenität werden die Peptide aktuell im Hinblick auf die intrinsische Immunogenität, Immundominanz und die Häufigkeit der Gedächtnisantworten in peripheren mononukleären Blutzellen von gesunden Spendern charakterisiert. Die vielversprechendsten Peptide in diesem gemeinsamen Projekt werden bezüglich ihrer Fähigkeit, spezifische Zytotoxizität gegen HPV-transformierte Zellen zu induzieren, untersucht. Zusammengenommen kann so eine Selektion von Epitopen erfolgen, die die Aufnahme in epitopspezifische Vakzinformulierungen für zukünftige klinische Studien bestimmt. Schlussendlich sind die hier beschriebenen Ergebnisse ein erheblicher Beitrag zum rationalen Design eines therapeutischen HPV16-Vakzins, dass in einem Großteil der Bevölkerung anwendbar ist.