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Abstract

Adoptive cell therapies (ACT) employing Chimeric Antigen Receptors (CARs) or T cell receptors (TCRs), either personalized or off-the-shelf, have demonstrated promising results in cancer treatment. However, the current T cell engineering methods utilizing viral vectors face significant challenges due to their immunogenicity and potential for insertional mutagenesis. Furthermore, large-scale manufacturing of viral vectors is time-consuming and costly, posing obstacles for the application of CAR or TCR-transgenic T cells in personalized cancer immunotherapy with limited therapeutic windows. This thesis uses an alternative non-viral genetic engineering approach of T cells with nano Scaffold/Matrix attachment region (nS/MAR) Vector technology, which holds potential for enhancing T cell-based therapies. These S/MAR DNA nanovectors, existing episomally and independent of antibiotic selection, offer numerous advantages over viral vectors. These benefits include cost-effectiveness, simplified manufacturing processes, reduced regulatory requirements, and the ability to modify T cells without the associated risk of mutagenesis while ensuring genetic transmission to daughter cells across unlimited cell divisions. Moreover, these vectors have no size limitations, facilitating the incorporation of larger transgenes, multiple expression cassettes, as well as desired gene regulatory and enhancer elements. My work demonstrates the universal applicability of nS/MAR vectors for genetically modifying T cells in the field of ACT with broad applicability for CARs and TCRs transgenic receptors. nS/MAR vectors enable persistent reporter gene expression, such as GFP, in both cell lines and primary human T cells, without random integration or electroporation-induced cell toxicity. Furthermore, nS/MAR CAR-T cells exhibit comparable or superior anti-tumor efficacy to viral and other non-viral systems in several tumor models. Additionally, the versatility and efficacy of this technology in generating both off-the-shelf and patient-specific TCR-T cells were demonstrated in vitro. The platform also demonstrates potential in developing constructs with multiple expression cassettes, such as T cells redirected for antigen-unrestricted cytokine-initiated killing (TRUCKs), which enhance T cells with inducible cytokines, promising an improved therapeutic outcome in patients with brain tumor. Furthermore, this thesis investigates the potential translation of the nS/MAR technology into clinical applications. The developed streamlined manufacturing process reduces regulatory requirements, time and costs, as well as enhances safety, making personalized T cell therapies more accessible to patients with limited treatment windows, such as those with brain tumors. Overall, this platform represents an opportunity to improve patient outcomes and expand the application of non-viral CAR and TCR therapy in clinical practice.

Translation of abstract (German)

Adaptive Zelltherapien (AZT) verwenden chimäre Antigenrezeptoren (CARs) oder T- Zellrezeptoren (TZRs), wobei sowohl personalisierte Rezeptoren als auch bereits etablierte Rezeptoren vielversprechende Ergebnisse in der Krebstherapie erzielen konnten. Aktuell werden zur Modifizierung von T-Zellen virale Vektoren verwendet, die jedoch Probleme wie Immunogenität und das Risiko einer Insertionsmutagenese mit sich bringen. Zusätzlich fallen bei der zeitaufwendigen Virusproduktion im großen Maßstab hohe Kosten an, was die Applikation von CAR- oder TZR-transgenen T-Zellen in der personalisierten Immuntherapie mit bereits limitierten therapeutischen Fenster weiter einschränkt. In dieser Doktorarbeit wird ein nicht-viraler Ansatz zur genetischen Modifizierung von T- Zellen mithilfe der nS/MAR Vektor Technologie verwendet, der das Potenzial besitzt, T- Zell-basierte Therapien leichter zu ermöglichen. Diese S/MAR DNA Nanovektoren, die Episomal persistieren und keine Antibiotikaselektion benötigen, besitzen eine Vielzahl an Vorteilen im Vergleich zu viralen Vektoren. Zu diesen Vorteilen zählt die Kosteneffizienz, ein im Vergleich zu viralen Produkten erleichterter Herstellungsprozess, geringere regulatorische Anforderungen, und die Möglichkeit, T-Zellen ohne das assoziierte Risiko einer Mutagenese zu modifizieren, während dennoch sichergestellt ist, dass das Gen unbegrenzt an Tochterzellen vererbt werden kann. Darüber hinaus haben diese Vektoren keine Limitation in Bezug auf die Größe der Plasmide, was die Integration von größeren Transgenen, mehreren Expressionskassetten, oder auch genregulatorischen- und Enhancer- Elementen ermöglicht. Meine Arbeit demonstriert die universelle Anwendbarkeit der nS/MAR Vektoren für die genetische Modifizierung von T-Zellen im Bereich von AZT mit breiter Anwendbarkeit für CAR und TZR-transgenen T-Zellen. nS/MAR Vektoren ermöglichen die dauerhafte Expression von Reporter Genen wie GFP, sowohl in Zelllinien als auch in primären humanen T-Zellen, ohne dass diese sich willkürlich integrieren und ohne Induktion von zellulärer Toxizität als Folge der Elektroporation. Des Weiteren werden durch nS/MAR CAR T-Zellen vergleichbare oder überlegene anti-Tumor Effekte im Vergleich zu viralen oder nicht-viralen Systemen in verschiedenen Tumormodellen ausgelöst. Zusätzlich wurde die Vielseitigkeit und Effizienz dieser Technologie sowohl mit bereits etablierten als auch Patienten-spezifischen TZR T-Zellen in vitro demonstriert. The Plattform beweist auch ihr Potenzial dadurch, dass es möglich ist, Konstrukte mit mehreren Expressionskassetten zu verwenden, wie zum Beispiel TRUCKs. Diese fördern T-Zell-Antworten durch induzierbare Zytokine, wodurch verbesserte therapeutische Erfolge in Patienten mit Hirntumoren erwartet werden können. Des Weiteren wurde in dieser Doktorarbeit die mögliche Translation der nS/MAR Technologie in die klinische Praxis untersucht. Der entwickelte optimierte Herstellungsprozess verringert im Vergleich zu viralen Systemen regulatorische Anforderungen, Zeitaufwand und Kosten, und erhöht die Sicherheit der Technologie, wodurch personalisierte T-Zell-Therapien auch für Patienten mit limitiertem therapeutischem Fenster zugänglich wird, zu denen auch Patienten mit Hirntumoren zählen. Insgesamt repräsentiert diese Plattform eine Möglichkeit, bessere Therapieerfolge in Patienten zu erreichen und nicht-viraler TZR-Therapie in die klinische Praxis zu überführen.