German Title: Optimierung der Mikroskopie in drei Dimensionen: Optische Klärungstechniken zur Analyse von hiPSC-abgeleiteten neuralen Sphäroiden und 3D-Zellkulturen

Preview

PDF, English - main document Download (8MB) | Terms of use

Abstract

3D cell cultures are a significant advancement in cell biology, providing a more physiologically relevant environment compared to traditional 2D cultures. One notable application involves the neural differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into complex 3D structures, like brain organoids, which closely resemble fetal brain development and are able to recapitulate complex processes in the human brain. While these models hold great promise for studying human brain development and diseases, they pose several challenges: a high level of expertise is necessary to generate these cultures, they are expensive to maintain, and exhibit a high variability between cell lines and experiments. In contrast, stable neural precursor cells (NPCs) derived from hiPSCs, while possessing lower differentiation potential and complexity, offer a more practical and consistent method for generating human neural cells in vitro. Unfortunately, the microscopic analysis of 3D-cultures presents difficulties owing to the intricate, extensively branched structure of neural cells, which span considerable distances, rendering it challenging to extract comprehensive information solely from cryosectioning techniques. One viable approach for analyzing these models involves whole mount confocal laser scanning microscopy (CLSM), which utilizes the intact sample for 3D visualization. However, optical effects, such as lateral light scattering due to refractive index (RI) mismatches prevent the generation of high-quality images beyond imaging depths of ~50 µm. Optical tissue clearing (OTC) techniques are a means to overcome these limitations by homogenizing the RI across the sample and enabling image acquisition at high resolution deep into biological specimens. Although OTC protocols have been thoroughly examined in tissue, their application was seldom extended to in vitro systems. In the limited studies conducted on this topic, a substantial variation in optical clearing efficiency is observed across different methods and cell lines, indicating the absence of a universal gold standard in this field of research. The presented work describes the establishment of a 3D-spheroid model of hiPSC-derived NPCs, which can be generated in low attachment microwell plates, and which can be differentiated into a mixture of neurons and astrocytes. The differentiation process was monitored in cryosections over an extended time period of 50 days for marker proteins indicative of proliferation, apoptosis, as well as neuronal and astroglial differentiation. The results show a constant growth of spheroids over a period of two weeks, which correlated with KI67-expression level. Markers for young neurons were already present at the start of 3D-cultivation, whereas astrocytes emerged at a later differentiation state. While proportions of neural cells changed over time, a steady pool of SOX2+ NPCs was maintained throughout the cultivation period. Furthermore, a range of optical tissue clearing methods were established and evaluated for their effectiveness in clearing hiPSC-derived NPC spheroids. Specifically, ClearT2, CytoVista, ScaleS, and an 88% glycerol solution were tested to determine their capacity to maintain sample size while enhancing optical transparency. This assessment was conducted through a depth-dependent analysis of signal intensity and signal-to-noise ratio (SNR), as well as suitability for semi-automated image segmentation of nuclear signals. Although results showed the highest degree of spheroid size preservation upon ScaleS clearing, remaining analyses confirm superiority of glycerol clearing with respect to optical transparency and image quality. Furthermore, in addition to optical clearing of undifferentiated hiPSC-derived neural spheroids, glycerol clearing was applied to differentiated spheroids which were then subjected to light sheet fluorescence microscopy (LSFM). This confirmed the method's applicability to both undifferentiated and differentiated 3D samples. In the light of high variability of optical clearing efficiency in 3D-in vitro systems reported in literature, ClearT2, CytoVista, ScaleS, and 88% glycerol were applied to additional cell culture models of varying complexity. These included four monoculture spheroid models, one complex tri-culture model of skin cancer and a chip-based co-culture model. Obtained results show a high degree of variability between the respective methods and cell culture models with respect to fluorescent dye preservation and optical transparency. Overall, optical clearing with glycerol proved to be the most reliable method across all models, although clearing efficiency was generally affected by the complexity of the cell culture model. Furthermore, application of linear z-compensation during imaging substantially improved image segmentation by stabilizing signal intensity and SNR across the sample dimensions.

Translation of abstract (German)

3D-Zellkulturen stellen einen bedeutenden Fortschritt in der Zellbiologie dar und bieten im Vergleich zu traditionellen 2D-Kulturen oftmals eine physiologischere Umgebung. Eine hervorzuhebende Anwendung ist die neuronale Differenzierung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) in komplexe 3D-Strukturen wie Gehirnorganoide, die der Entwicklung des fetalen Gehirns stark ähneln und in der Lage sind, komplexe Prozesse im menschlichen Gehirn nachzubilden. Diese Modelle sind zwar vielversprechend für die Untersuchung von Krankheiten und der Entwicklung des menschlichen Gehirns, stellen jedoch auch mehrere Herausforderungen dar. Für die Herstellung dieser Kulturen ist ein hohes Maß an Expertise erforderlich, die Kultivierung ist teuer und die Variabilität zwischen Zelllinien und Experimenten ist hoch. Im Gegensatz dazu bieten stabile neurale Vorläuferzellen (NPCs), die von hiPSCs abgeleitet sind, zwar ein geringeres Differenzierungspotenzial und eine geringere Komplexität, aber auch eine kosteneffizientere und konsistentere Methode zur Erzeugung menschlicher neuraler Zellen in vitro. Die Analyse von neuronalen 3D-Kulturen mit Hilfe von Mikroskopie gestaltet sich jedoch schwierig. Die komplexe Struktur von neuronalen Zellen, deren feine Verzweigungen sich durch das ganze Sphäroid erstrecken können, macht es nahezu unmöglich räumliche Informationen mit Hilfe traditioneller Methoden wie Kryoschnitten abzubilden. Ein praktikabler Ansatz ist die gesamtheitliche in toto-Analyse dieser Modelle mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM). Jedoch verhindern optische Effekte wie laterale Lichtstreuung aufgrund von Unterschieden im Brechungsindex (RI) die Erzeugung hochwertiger Bilddaten jenseits von Tiefen von etwa 50 µm. Techniken zur optischen Gewebeklärung (OTC) bieten Möglichkeiten, diese Einschränkungen zu überwinden, indem sie den RI im gesamten Probenmaterial homogenisieren und die Aufnahme hochauflösender Bilder tief in biologischen Proben ermöglichen. Obwohl OTC-Protokolle in Geweben umfassend untersucht wurden, wird ihre Anwendung selten auf in vitro Systeme übertragen. In den begrenzten Studien zu diesem Thema wurde eine erhebliche Variation in der optischen Klärungseffizienz zwischen verschiedenen Methoden und Zelllinien festgestellt, was darauf hindeutet, dass es in diesem Forschungsbereich keinen universellen Goldstandard gibt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines 3D-Sphäroidmodells aus hiPSC-abgeleiteten NPCs, welches zu einer Mischung aus Neuronen und Astrozyten differenziert werden kann. Der Differenzierungsprozess wurde in Kryoschnitten über einen Zeitraum von 50 Tagen überwacht und umfasste die Analyse von Markerproteinen für Proliferation, Apoptose sowie neuronale und astrogliale Differenzierung. Die Ergebnisse zeigten ein ständiges Wachstum der Sphäroide über einen Zeitraum von zwei Wochen hinweg, welches mit dem KI67-Expressionsniveau korrelierte. Marker für junge Neuronen waren bereits zu Beginn der 3D-Kultivierung nachweisbar, während Astrozyten in einem späteren Differenzierungsstadium auftraten. Trotz der sich ändernden Anteile von neuralen Zellen im Laufe der Zeit blieb eine konstante Population von SOX2+ NPCs während des gesamten Kultivierungszeitraums erhalten. Darüber hinaus wurden eine Reihe von optischen Gewebeklärungsmethoden etabliert und auf ihre Wirksamkeit bei der Klärung von hiPSC-abgeleiteten NPC-Sphäroiden hin untersucht. Konkret wurden ClearT2, CytoVista, ScaleS und eine 88%ige Glycerinlösung auf ihre Fähigkeit getestet, die Sphäroidgröße zu erhalten und die optische Transparenz zu verbessern. Diese Bewertung wurde durch eine tiefenabhängige Analyse der Signalintensität und des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR), sowie der Eignung für die halbautomatische Bildsegmentierung von Zellkernsignalen durchgeführt. Obwohl ScaleS-Klärung im Hinblick auf die Erhaltung der Sphäroidgröße optimale Resultate erzielen konnte, bestätigen die verbleibenden Analysen die Überlegenheit der Glycerin-Klärung in Bezug auf optische Transparenz und Bildqualität. Darüber hinaus wurde, zusätzlich zur optischen Klärung von undifferenzierten hiPSC-abgeleiteten neuronalen Sphäroiden, die Glycerin-Klärung auf differenzierte Sphäroide angewendet und diese mittels Lichtblattmikroskopie (LSFM) untersucht. Diese zusätzlichen Experimente bestätigten die Anwendbarkeit der Methode auf sowohl undifferenzierte als auch differenzierte 3D-Proben. Angesichts der hohen Variabilität der optischen Klärungseffizienz in 3D-in-vitro-Systemen, wurden ClearT2, CytoVista, ScaleS und 88% Glycerin auf zusätzliche Zellkulturmodelle unterschiedlicher Komplexität angewendet. Diese umfassten vier weitere Monokultur-Sphäroid-Modelle, ein komplexes Trikultur-Modell und ein Chip-basiertes Co-Kultur-Modell. Die erzielten Ergebnisse zeigen einen hohen Grad an Variabilität zwischen den jeweiligen Methoden und Zellkulturmodellen in Bezug auf die Erhaltung von Fluoreszenzfarbstoffen und optische Transparenz. Insgesamt erwies sich die optische Klärung mit Glycerin als die zuverlässigste Methode für alle Modelle, wobei die Kläreffizienz insgesamt von der Komplexität des Zellkulturmodells beeinflusst wurde. Darüber hinaus konnte die Anwendung der linearen Z-Kompensation während der Bildaquise die Segmentierung erheblich verbessern, indem sie die Signalintensität und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) über die Abmessungen der Probe stabilisierte.