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Abstract

All blood and immune cells share the same developmental origin but have diverse functions. Hematopoietic stem cells play a central role in hematopoiesis, as reflected by their ability of multilineage reconstitution of lethally irradiated mice. Recent advancements in DNA barcoding showed that hematopoietic stem cells are not functionally uniform but have heterogenous fates (multilineage, myeloid-erythroid restricted, or differentiation-inactive). The time of hematopoietic stem cells fate specification (embryonically or postnatally) and the stability of distinct fates (at steady state or during transplantation) remain largely unknown. Of note, while DNA barcoding can reveal physiological fates in vivo, it cannot provide molecular insights into fate regulation. To approach these key questions, a next generation barcoding system, PolyloxExpress, was developed. By transcribing the DNA barcodes into RNA, PolyloxExpress allows high-resolution barcoding at both DNA and RNA levels. Applying the PolyloxExpress system in mice and focusing on DNA barcodes, I analyzed hematopoietic stem cell fates at embryonic stages, and found the same fate patterns as in adult stem cells, indicating very early fate determination. To temporally resolve hematopoietic stem cell output in adult life, peripheral blood was repeatedly collected from individual barcoded mice. Distinct stem cell fates remained largely stable over time in both native hematopoiesis and after transplantation, suggesting that hematopoietic stem cell fates are determined cell-intrinsically. To link fates to transcriptomes, I combined PolyloxExpress with single-cell RNA sequencing and established a customized protocol for simultaneous recovery of full-length RNA barcodes and transcriptome. These experiments uncovered that fate-defined hematopoietic stem cell occupied different regions on the transcriptional landscape and have hence, at least partially, distinct transcriptome signatures. These fate-associated signatures were not apparent when analyzing transcriptome alone, which underscores the importance of obtaining fate and transcriptome information together. These data also contain transcripts with uncharacterized functions in stem cells, which may provide a unique resource for future studies. Collectively, PolyloxExpress barcoding revealed coherent hematopoietic stem cell fates which are cell-intrinsically determined and arise around the time of hematopoietic stem cell emergence in the embryo. Fate-associated transcriptome signatures could be identified. Combining PolyloxExpress with single-cell multiomics techniques will provide further insights into molecular aspects of cell fate determination.

Translation of abstract (German)

Alle Blut- und Immunzellen haben denselben Entwicklungsursprung, zeigen aber unterschiedliche Funktionen. Hämatopoetische Stammzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Hämatopoese, wie ihre Fähigkeit zur Rekonstitution der unterschiedlichen Zelllinien in letal bestrahlten Mäusen zeigt. Jüngste Fortschritte bei der Technologie der experimentellen Zellmarkierung durch DNA-Barcodes haben gezeigt, dass hämatopoetische Stammzellen keine einheitliche Population bilden, sondern selbst unter natürlichen Bedingungen einem heterogenen Differenzierungsschicksal unterliegen. Der Zeitpunkt der Spezifikation des hämatopoetischen Stammzellschicksals (embryonal oder postnatal) und die Stabilität der verschiedenen hämatopoetischen Differenzierungsschicksale (im natürlichen Gleichgewicht und bei Transplantation oder Infektion) sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Außerdem können DNA-Barcodes zwar physiologische Schicksale in vivo aufzeigen, aber keine molekularen Einblicke in die Schicksalsregulierung liefern. Um diese wichtigen Fragen zu klären, wurde PolyloxExpress, als nächste Generation des zellulären Barcode-Reportersystems Polylox, entwickelt. Durch die Transkription der DNA-Barcodes in RNA ermöglicht PolyloxExpress hochauflösende Barcode-Markierung sowohl auf DNA- als auch auf RNA-Ebene. Unter Anwendung des PolyloxExpress Systems in Mäusen und der Fokussierung auf DNA-Barcodes habe ich die Schicksale hämatopoetischer Stammzellen im Embryonalstadium analysiert und dieselben Muster wie bei adulten hämatopoetischen Stammzellen gefunden, was auf eine sehr frühe Festlegung des Schicksals hinweist. Um die Produktion hämatopoetischer Stammzellen im Erwachsenenalter zeitlich aufzulösen, wurde peripheres Blut wiederholt von einzelnen mit Barcodes markierten Mäusen entnommen. Interessanterweise blieben die verschiedenen hämatopoetischen Stammzellschicksale sowohl in der nativen Hämatopoese als auch nach Transplantation weitgehend stabil, was darauf hindeutet, dass die hämatopoetischen Stammzellschicksale zell-intrinsisch festgelegt werden. Um die Schicksale und ihre molekularen Bestimmungs¬faktoren in Verbindung zu bringen, habe ich das PolyloxExpress Reportersystem mit der Einzelzell-RNA-Sequenzierung kombiniert und ein maßgeschneidertes Protokoll, zur gleichzeitigen Gewinnung von RNA-Barcodes in voller Länge und des Transkriptoms aus hämatopoetischen Stammzellen, entwickelt. Die Analyse von Barcode-markierten Mäusen mit diesem Protokoll ergab, dass hämatopoetische Stammzellen abhängig von ihrem Differenzierungsschicksal verschiedene Regionen einer Computer-generierten Karte des Transkriptoms besetzen und daher zumindest teilweise unterschiedliche Genexpressions¬signaturen aufweisen. Diese Schicksals-assoziierten Signaturen waren bei der alleinigen Analyse des Transkriptoms nicht erkennbar, was die Bedeutung der Gewinnung von Schicksalsinformationen in Verbindung mit der Transkriptomanalyse unterstreicht. Diese Daten könnten für zukünftige Studien eine wertvolle Ressource darstellen, da sie auch Transkripte enthalten, deren Funktion in Stammzellen bislang unbekannt ist. Zusammengefasst enthüllte das PolyloxExpress Barcode System kohärente hämatopoetische Stammzellschicksale, die zell-intrinsisch determiniert sind und um den Zeitpunkt der Entstehung der hämatopoetischen Stammzellen im Embryo entstehen. Schicksals-assoziierte Transkriptom-Signaturen konnten identifiziert werden. Zukünftige Arbeiten, bei denen das PolyloxExpress Reportersystem mit neuesten genomischen Einzelzelltechniken kombiniert wird, werden weitere tiefe Einblicke in molekulare Aspekte der Bestimmung des Zellschicksals ermöglichen.