German Title: Untersuchung der Induktion und Interferenzmechanismen der angeborenen Immunität von Hepatitis A- und C-Viren in menschlichen Hepatozyten

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Abstract

This dissertation focuses on the host innate immune response in the context of hepatitis A virus (HAV) and hepatitis C virus (HCV) infections in human hepatocytes. Innate immunity is the body's first line of defense against invading pathogens, functioning via a network of cells and molecules that quickly respond to infections. Central to this response are pattern recognition receptors (PRRs), which recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and trigger the production of Interferons (IFNs) and the expression of Interferon-Stimulated Genes (ISGs), critical to antiviral defenses. In the case of viral infections like HAV and HCV, the host's immune response plays a pivotal role in disease outcome, and these viruses, in turn, have developed strategies to evade and manipulate the immune system. Thus, the interplay between viruses and the host's immune response is a key aspect of viral pathogenesis. HAV and HCV are both positive-strand RNA (+ssRNA) hepatotropic viruses with a strict human tropism. Despite sharing a number of similarities in terms of genome structure and replication, they have unique characteristics and induce different immune responses, with HAV being cleared and HCV establishing chronic infections in >70% of the cases, making them intriguing subjects for comparative studies. Notably, the only comparative in vivo study conducted on HAV and HCV-infected chimpanzees revealed that HAV, albeit replicating to a higher degree than HCV, barely elicited an innate immune response, as opposed to that solidly mounted upon HCV infection. This was attributed to a potent counteractive activity by the HAV protease 3C, and their precursors 3CD and 3ABC, towards the PRRs pathways. Therefore, I aimed at elucidating how HAV and HCV triggered, and counteracted, the intrinsic immune response in the liver, potentially associating these mechanisms to their strikingly different infection outcomes. To this aim, I employed relevant cell culture models to examine the efficiency with which HAV and HCV were sensed by endoplasmic Toll-Like-Receptor 3 (TLR3) and the cytoplasmic Rig-I-Like-Receptors (RLRs). I furthermore quantified the proteolytical cleavage of the TLR3 adaptor TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) and the RLR adaptor Mitochondrial Antiviral-Signaling protein (MAVS) via transient and stable expression of the respective viral proteases. My results indicated that both HAV and HCV infections induced similar levels of ISGs and IFNs in human hepatocytes, signaling the activation of innate immunity. HAV sensing primarily involved Melanoma Differentiation-Associated protein 5 (MDA5) and Laboratory of Genetics and Physiology 2 (LGP2), with limited interference to MAVS and to TRIF by the HAV proteases 3ABC and 3CD. In contrast, HCV sensing by Retinoic acid-Inducible Gene I (RIG-I) and MDA5 was entirely blocked by the efficient cleavage of the RLRs adaptor protein MAVS, leading to the activation of TLR3 as the primary source of ISG response for HCV. TRIF, the adaptor protein for TLR3, was not cleaved by HCV NS3-4A, contrary to previous reports. In addition, my research found that Huh7 cells were found to be defective on the MDA5-LGP2 axis. My approach then shifted to an in vivo examination of SCID Alb-uPA humanized mice infected with patient-derived as well as cell culture adapted HAV and HCV, where I observed that both HAV and HCV triggered ISGs to similar extents, confirming the results obtained in vitro. Overall, my results suggest that while HCV primarily triggers a TLR3-mediated response, HAV relies on an MDA5-mediated sensing mechanism, which is not sufficiently blocked. This challenges the established understanding that HAV does not induce IFN, or fully inhibits them, in infected hepatocytes both in vitro and in vivo. However, caution must be applied when interpreting both the results in vitro, due to models with limited physiological relevance, and in vivo, due to a limited number of animals. These findings underscore the need for fully immunocompetent animal models to carry out comprehensive investigations of the determinants of viral persistence and clearance, which are currently lacking.

Translation of abstract (German)

Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Forschungsarbeit konzentriert sich auf die angeborene Immunität, insbesondere auf die Untersuchung der Immunantwort des Wirts im Zusammenhang mit Hepatitis-A- (HAV) und Hepatitis-C- (HCV) Infektionen in der menschlichen Leber. Die angeborene Immunität ist die erste Verteidigungslinie des Körpers gegen eindringende Krankheitserreger und funktioniert über ein Netzwerk von Zellen und Molekülen, die schnell auf Infektionen reagieren. Im Mittelpunkt dieser Reaktion stehen Pattern Recognition Receptors (PRRs), die Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) erkennen und die Produktion von Interferonen (IFNs) sowie die Expression von durch Interferon Stimulated Genes (ISGs) auslösen, die für die antivirale Abwehr entscheidend sind. Bei Virusinfektionen wie HAV und HCV spielt die Immunantwort des Wirts eine entscheidende Rolle für den Krankheitsverlauf, und diese Viren haben ihrerseits Strategien entwickelt, um das Immunsystem zu umgehen und zu manipulieren. Daher ist das Zusammenspiel zwischen Viren und der Immunantwort des Wirts ein wichtiger Aspekt der viralen Pathogenese. HAV und HCV sind beide positive-strand (+ssRNA) Viren mit striktem Tropismus für den Menschen. Obwohl sie eine Reihe von Gemeinsamkeiten in Bezug auf Genomstruktur und Replikation aufweisen, haben sie einzigartige Merkmale und lösen unterschiedliche Immunreaktionen aus, wobei HAV in >70 % der Fälle beseitigt wird und HCV chronische Infektionen verursacht, was sie zu interessanten Themen für vergleichende Studien macht. Die einzige vergleichende In-vivo-Studie, die an HAV- und HCV-infizierten Schimpansen durchgeführt wurde, ergab, dass HAV, obwohl es sich in höherem Maße repliziert als HCV, kaum eine angeborene Immunreaktion hervorruft, während HCV-Infektionen eine solide Immunantwort auslösen. Dies wurde auf eine starke Gegenaktivität der HAV-Protease 3C und ihrer Vorläufer 3CD und 3ABC gegenüber den PRR-Signalwegen zurückgeführt. Daher wollte ich herausfinden, wie HAV und HCV die intrinsische Immunantwort in der Leber auslösen und ihr entgegenwirken, was möglicherweise mit den auffallend unterschiedlichen Infektionsergebnissen zusammenhängt. Zu diesem Zweck habe ich relevante Zellkulturmodelle verwendet, um die Effizienz zu untersuchen, mit der HAV und HCV durch den endoplasmatischen Toll-Like-Receptor 3 (TLR3) und die zytoplasmatischen Rig-I-Like-Receptors (RLRs) wahrgenommen wurden. Außerdem habe ich die proteolytische Spaltung des TLR3-Adaptors TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) und des RLR adaptor Mitochondrial Antiviral-Signaling protein (MAVS) durch transiente und stabile Expression der jeweiligen viralen Proteasen quantifiziert. Meine Ergebnisse zeigten, dass sowohl HAV- als auch HCV-Infektionen ähnliche Mengen an ISGs und IFNs in menschlichen Hepatozyten induzieren, was die Aktivierung der angeborenen Immunität signalisiert. Am HAV-Sensing waren in erster Linie das Melanoma Differentiation-Associated protein 5 (MDA5) und das Laboratory for Genetic and Physiology 2 (LGP2) beteiligt, wobei die HAV-Proteasen 3ABC und 3CD nur begrenzt auf MAVS und TRIF einwirkten. Im Gegensatz dazu wurde die HCV-Erkennung durch das durch Retinoic acid-Inducible Gene I (RIG-I) und MDA5 durch die effiziente Spaltung des RLR-Adapterproteins MAVS vollständig blockiert, was zur Aktivierung von TLR3 als primäre Quelle der ISG-Antwort für HCV führte. TRIF, das Adaptorprotein für TLR3, wurde im Gegensatz zu früheren Berichten nicht von HCV NS3-4A gespalten. Darüber hinaus ergab meine Untersuchung, dass Huh7-Zellen auf der MDA5-LGP2-Achse defekt sind. Mein Ansatz verlagerte sich dann auf eine in-vivo-Untersuchung von humanisierten SCID-Alb-uPA-Mäusen, die mit von beiden Patienten und Zellkultur-stammenden HAV- und HCV-Viren infiziert waren, wobei ich ein ähnliches Ausmaß an angeborener Immunantwort bei HAV- und HCV-Infektionen sehen konnte, die die in vitro Ergebnisse bestätigt. Insgesamt deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass HCV in erster Linie eine TLR3-vermittelte Reaktion auslöst, während HAV auf einen MDA5-vermittelten Erkennungsmechanismus angewiesen ist, der nicht ausreichend blockiert wird. Dies stellt die bisherige Erkenntnis in Frage, dass HAV in infizierten Hepatozyten sowohl in vitro als auch in vivo kein IFN induziert oder diese vollständig hemmt. Allerdings ist bei der Interpretation der Ergebnisse sowohl in vitro aufgrund von Modellen mit begrenzter physiologischer Relevanz als auch in vivo Vorsicht geboten, da sie von einer begrenzten Anzahl von Tieren stammen. Diese Ergebnisse unterstreichen den Bedarf an vollständig immunkompetenten Tiermodellen, um umfassende Untersuchungen zu den Determinanten der viralen Persistenz und Clearance durchführen zu können, an denen es derzeit mangelt.