German Title: Untersuchung der Rolle von SHOX2 bei Vorhofflimmern unter Verwendung eines von Patienten generierten Modells humaner induzierter pluripotenter Stammzellen

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Abstract

The sinoatrial node (SAN) is the primary pacemaker of the heart, where the pulse necessary for cardiac contraction arises to be propagated to the cardiac chambers via the cardiac conduction system. The transcription factor short stature homeobox 2 ( SHOX2 ) is essential for the development and function of the SAN, activating a transcriptional program for pacemaker development while suppressing differentiation towards working myocardium during cardiogenesis. Variants in the SHOX2 gene have been associated with atrial fibrillation (AF), the most common cardiac arrhythmia. However, the pathomechanisms behind SHOX2 dependent AF and the SHOX2 regulatory genetic network have not been fully understood. Until now, the impact of Shox2 deficiency has only been investigated in mouse or zebrafish animal models. Therefore, the aim of this thesis was to gain new insights from a human background and to investigate whether data obtained via animal models can be transferred to a human model system. At the beginning of this work, two induced pluripotent stem cell (iPSC) lines from two different patients with early onset AF were available, carrying a heterozygous single nucleotide variant either in the 3’UTR or in the coding region of SHOX2. A targeted correction of these variants had already been performed to generate isogenic control lines. First, I generated two homozygous SHOX2 KO iPSC lines from the available cell lines and validated them using several methods. Furthermore, I established and adapted previously published differentiation protocols to generate pacemaker and atrial cardiomyocytes (CMs) from iPSCs. To uncover variant specific changes in the two patient lines that contribute to the disease phenotype, I performed comparative profiling with their isogenic controls using gene expression analysis, single cell RNA sequencing and electrical phenotyping. Gene expression profiling of iPSC derived CMs confirmed several deregulated gene expression patterns known from animal models and uncovered additional dysregulation. Data from Single cell RNA sequencing revealed a possibly impaired differentiation capability and disturbed mitochondrial function in the patient cells. In CMs of the 3’UTR variant patient line, changed action potential characteristics were discovered, which notably could be attributed to differential ion channel expression. M ost strikingly, upregulation of the Na+ channel SCN5A led to an increased action potential upstroke velocity and amplitude, and upregulation of several K+ channels caused a shortened repolarization time observed in the patient line. Thus, novel disease mechanisms causing SHOX2 dependent AF as well as underlying molecular mechanisms and potential targets for adapted treatment strategies could be uncovered. Overall, the established human iPSC model and the differentiated cardiac cell types provide a valuable tool to further dissect the detailed molecular mechanisms of SHOX2 dependent AF in the future.

Translation of abstract (German)

Der sinoatriale Knoten (SAN) ist der primäre Schrittmacher des Herzens. Hier entsteht der für die Herzkontraktion notwendige Impuls, der über das kardiale Reizleitungssystem an die Herzkammern weitergeleitet wird. Short Stature Homeobox 2 (SHOX2) ist ein für die Entwicklung und Funktion des SAN wesentlicher Transkriptionsfaktor, der während der Kardiogenese ein Transkriptionsprogramm für die Entwicklung des Schrittmachers aktiviert, während die Differenzierung zum Arbeitsmyokard unterdrückt wird. Varianten im SHOX2-Gen wurden mit Vorhofflimmern assoziiert, der häufigsten Herzrhythmusstörung. Die Pathomechanismen, die dem SHOX2-abhängigen Vorhofflimmern zugrunde liegen, sowie das genetische SHOX2-Regulationsnetzwerk sind jedoch noch unvollständig geklärt. Bislang wurden die Auswirkungen eines Shox2-Defizits nur in Tiermodellen von Mäusen oder Zebrafischen untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue Erkenntnisse aus einem humanen Modellsystem zu gewinnen und zu untersuchen, ob sich die über Tiermodelle gewonnenen Daten auf ein humanes Modellsystem übertragen lassen. Zu Beginn dieser Arbeit standen zwei induzierte pluripotente Stammzelllinien (iPSC) zweier unterschiedlicher Patienten mit früh einsetzendem Vorhofflimmern bereits zur Verfügung, die eine heterozygote Einzelnukleotidvariante entweder in der 3’UTR oder in der kodierenden Region von SHOX2 tragen. Eine gezielte Korrektur dieser Varianten war bereits durchgeführt worden, um isogene Kontrolllinien zu erzeugen. Zunächst habe ich aus den vorhandenen Zelllinien zwei homozygote SHOX2 KO iPS-Zelllinien generiert und mit verschiedenen Methoden validiert. Darüber hinaus habe ich bereits veröffentlichte Differenzierungsprotokolle etabliert und angepasst, um aus iPSCs Schrittmacher- und Vorhof-Kardiomyozyten (KM) zu erzeugen. Um variantenspezifische Veränderungen in den Patientenlinien aufzudecken, die zum Krankheitsphänotyp beitragen, führte ich vergleichende Analysen mit ihren isogenen Kontrollen durch, wobei Genexpressionsanalysen, Single-cell-RNA-Sequenzierung und elektrische Phänotypisierung verwendet wurden. Die Analyse von Genexpressionsprofilen von iPSC KM bestätigte einige aus Tiermodellen bekannte deregulierte Genexpressionsmuster und deckte zusätzliche Dysregulationen auf. Die Daten der Single-cell-RNA-Sequenzierung zeigten eine möglicherweise beeinträchtigte Differenzierungsfähigkeit und gestörte mitochondriale Funktion in den Patientenzellen. In KMs der 3'UTR-Varianten-Linie wurden veränderte Eigenschaften des Aktionspotenzials entdeckt, die insbesondere auf unterschiedliche Expression von Ionenkanälen zurückgeführt werden konnten. Am auffälligsten war die Hochregulierung des Na+-Kanals SCN5A, die zu einer erhöhten Aufwärtsgeschwindigkeit des Aktionspotenzials und der - Amplitude führte, sowie die Hochregulierung mehrerer K+-Kanäle, welche eine verkürzte Repolarisationszeit in der Patientenlinie auslöste. Somit konnten neue Krankheitsmechanismen, die SHOX2-abhängiges Vorhofflimmern verursachen, sowie die ihnen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und damit mögliche Angriffspunkte für angepasste Behandlungsstrategien aufgezeigt werden. Insgesamt stellen das etablierte humane iPSC-Modell und die daraus generierten kardialen Zelltypen ein wertvolles Instrument dar, um die molekularen Mechanismen von SHOX2-abhängigen Vorhofflimmern zukünftig weiter detailliert zu entschlüsseln.