German Title: Intraklonale Heterogenität der Genexpression bei menschlichem kolorektalem Krebs

PDF, English - main document Restricted access: Repository staff only until 19 April 2025. Login+Download (8MB) | Terms of use

Abstract

Colorectal cancer (CRC) harbors heterogeneous subclonal cell populations that contribute to tumor progression, metastasis and therapy resistance. Subclonal heterogeneity arises not only from genetic and epigenetic differences, but also from functional heterogeneity of subclones sharing homogeneous genetic features. Genetic barcoding approaches have shown that subclones with long-term tumor-initiating cell (LT-TIC) activity are capable of fueling CRC expansion to metastasis and that CRC subclones can enter a drug tolerant persister state to tolerate chemotherapy. Nevertheless, subclonal transcriptional features which characterize functional states, such as treatment response and metastasis, are underexplored. Characterizing how subclonal gene expression contributes to functional states of CRC enhances understanding the dynamics of tumor progression. Here, I describe subclonal dynamics in addition to associated single cell transcriptomics of treatment response and metastasis in barcoded CRC patient-derived organoids (PDOs) and xenografts, respectively. To study subclonal gene expression heterogeneity in metastatic and therapy resistant populations, I transduced three CRC PDOs with a genetic RNA-expressed barcoding library for unique single cell marking. Barcoded PDOs were either orthotopically serially transplanted into NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) mice or treated with chemotherapy to study clonal and transcriptional dynamics in tumor progression to metastasis and in treatment response. I performed single cell RNA (scRNA) sequencing in addition to target barcode DNA sequencing on cells harvested from xenografts or treated PDOs to analyze clonal dynamics and subclonal gene expression programs. I found that combined scRNA data from more than 3.5x10E5 cells in xenografts demonstrated a drop in the number of clones by which 0.05-1% of detected clones formed the majority of cancer cells in serial transplantations of tumor, liver and lung metastasis, with an enrichment of few individual clones that drive tumor progression. The frequency of these enriched clones varied across serial transplantations of different tumor locations such as the tumor and metastases, suggesting a dynamic subclonal expansion in different microenvironments. Subclonal cell populations in both tumor and liver or lung metastases reflected distinct gene expression profiles of differentiated and undifferentiated intestinal cells. Differentiated epithelial profiles were reminiscent of epithelial intestinal cells such as absorptive enterocytes and secretory cells while undifferentiated cells shared transcriptional features of invasive and fetal/embryonic cell states. Individual metastatic subclones of liver metastasis showed higher expression of particular genes such as SOX4, VEGFA and PLCG2 which were enriched in the invasive fetal cell phenotype. Lung metastasis cells of the same subclones demonstrated higher expression of S100A11, ANXA1 and KRT19, which were elevated in the differentiated epithelial cell phenotype. In addition, clones which represent more than 25% of the tumor or metastasis cell population did not show reproducible gene expression differences in comparison to smaller clones forming less than 5% of the cell population. Upon chemotherapy treatment and recovery of PDOs, the frequency of individual clones was marginally affected in comparison to control DMSO treated cells, without a strong selection of particular clones. In response to treatment, cells reflected abundant pre-existing gene expression profiles reminiscent to those of intestinal enterocytes, undifferentiated cycling and progenitor cells and a low frequency of transcriptional profiles related to proliferative and secretory cells. One week after drug washout, stem cell transcriptional clusters, in addition to transcriptional clusters abundant in treatment response, were enriched. The functional relevance of 181 marker genes of treatment response-associated transcriptional clusters was assessed through a custom clustered regularly interspaced palindromic repeats interference (CRISPRi) screen, which demonstrated the depletion of 43 out of 52 significantly affected genes after chemotherapy treatment. Further, transposase-accessible chromatin single cell (scATAC) sequencing data from two PDOs treated with 5-Fluorouracil (5-FU) showed an open chromatin status in the region of genes detected to be differentially expressed in response-associated transcriptional clusters identified in scRNA data, thus linking gene transcription to epigenetic chromatin regulation. Overall, this study links clonal dynamics to transcriptional states, thereby dissecting gene expression of subclonal functional states of tumor progression. This analysis reveals that gene expression states and marker genes associated with metastasis and treatment response could be implemented in further development and validation of innovative treatment strategies in CRC.

Translation of abstract (German)

Das kolorektale Karzinom (CRC) beherbergt heterogene subklonale Zellpopulationen, die zur Tumorprogression, Metastasierung und Therapieresistenz beitragen. Die subklonale Heterogenität ergibt sich nicht nur aus genetischen und epigenetischen Unterschieden, sondern auch aus der funktionellen Heterogenität von Subklonen mit homogenen genetischen Merkmalen. Genetische Barcoding-Ansätze haben gezeigt, dass Subklone mit langfristiger tumorinitiierender Zellaktivität (LT-TIC) in der Lage sind, die Ausbreitung des kolorektalen Karzinoms bis hin zur Metastasierung voranzutreiben, und dass Subklone des kolorektalen Karzinoms in einen arzneimitteltoleranten Persistenzzustand übergehen können, um eine Chemotherapie zu tolerieren. Dennoch sind subklonale transkriptionelle Merkmale, die funktionelle Zustände wie das Ansprechen auf Behandlung und die Metastasierung charakterisieren, noch wenig erforscht. Die Charakterisierung des Beitrags der subklonalen Genexpression zu den funktionellen Zuständen des kolorektalen Karzinoms verbessert das Verständnis der Dynamik der Tumorprogression. Hier beschreibe ich die subklonale Dynamik sowie die damit verbundene Einzelzelltranskriptomik des Behandlungsansprechens und der Metastasierung in barcodierten patientenabgeleiteten CRC Organoiden (PDOs) und Xenotransplantaten von Kolorektalkarzinom-Patienten. Um die Heterogenität der subklonalen Genexpression in metastatischen und therapieresistenten Populationen zu untersuchen, habe ich drei CRC-PDOs mit einer genetischen RNA-exprimierten Barcoding-Bibliothek zur eindeutigen Einzelzellmarkierung transduziert. Barcodierte PDOs wurden entweder orthotopisch seriell in NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG)-Mäuse transplantiert oder mit Chemotherapie behandelt, um die klonale und transkriptionelle Dynamik bei der Tumorprogression bis zur Metastasierung und beim Ansprechen auf die Behandlung zu untersuchen. Ich habe die Sequenzierung von Einzelzell-RNA (scRNA) zusätzlich zur Sequenzierung von Ziel-Barcode-DNA an Zellen durchgeführt, die aus Xenotransplantaten oder behandelten PDOs gewonnen wurden, um die klonale Dynamik und subklonale Genexpressionsprogramme zu analysieren. Ich fand heraus, dass kombinierte scRNA-Daten von mehr als 3,5x10E5 Zellen in Xenotransplantaten einen Rückgang der Anzahl von Klonen zeigten, bei dem 0,05-1% der entdeckten Klone die Mehrheit der Krebszellen in seriellen Transplantationen von Tumor-, Leber- und Lungenmetastasen bildeten, mit einer Anreicherung von wenigen einzelnen Klonen, die das Tumorwachstum vorantreiben. Die Häufigkeit dieser angereicherten Klone variierte bei seriellen Transplantationen an verschiedenen Tumororten wie dem Tumor und Metastasen, was auf eine dynamische subklonale Expansion in verschiedenen Mikroumgebungen hindeutet. Subklonale Zellpopulationen sowohl im Tumor als auch in Leber- oder Lungenmetastasen spiegelten unterschiedliche Genexpressionsprofile von differenzierten und undifferenzierten Darmzellen wider. Differenzierte Epithelprofile erinnerten an epitheliale Darmzellen wie absorbierende Enterozyten und sekretorische Zellen, während undifferenzierte Zellen Transkriptionsmerkmale invasiver und fötaler/embryonaler Zellzustände aufwiesen. Einzelne metastatische Subklone der Lebermetastasen zeigten eine höhere Expression bestimmter Gene wie SOX4, VEGFA und PLCG2, die im Phänotyp der invasiven fötalen Zellen angereichert waren. Lungenmetastasenzellen derselben Subklone wiesen eine höhere Expression von S100A11, ANXA1 und KRT19 auf, die im differenzierten Epithelzell-Phänotyp erhöht waren. Darüber hinaus zeigten Klone, die mehr als 25% der Tumor- oder Metastasenzellpopulation ausmachen, keine reproduzierbaren Unterschiede in der Genexpression im Vergleich zu kleineren Klonen, die weniger als 5% der Zellpopulation ausmachen. Nach der Chemotherapie und der Wiederherstellung der PDOs wurde die Häufigkeit einzelner Klone im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Kontrollzellen nur geringfügig beeinflusst, ohne dass eine starke Selektion bestimmter Klone stattfand. Als Reaktion auf die Behandlung wiesen die Zellen reichlich vorbestehende Genexpressionsprofile auf, die an die von intestinalen Enterozyten, undifferenzierten zyklischen Zellen und Vorläuferzellen erinnerten, sowie eine geringe Häufigkeit von Transkriptionsprofilen, die mit proliferativen und sekretorischen Zellen zusammenhängen. Eine Woche nach dem Absetzen des Medikaments waren stammzellassoziierte Transkriptionscluster angereichert, zusätzlich zu den Clustern, die bei der Reaktion auf die Behandlung reichlich vorhanden waren. Die funktionelle Bedeutung von 181 Markergenen der mit der Behandlungsreaktion verbundenen Transkriptionscluster wurde mit Hilfe eines benutzerdefinierten CRISPRi-Screens (Clustered Regular Interspaced Palindromic Repeats interference) bewertet, der die Verringerung von 43 der 52 signifikant betroffenen Gene nach einer Chemotherapiebehandlung zeigte. Darüber hinaus zeigten Transposase-accessible chromatin single cell (scATAC) Sequenzierungsdaten von 2 PDOs, die mit 5-Fluorouracil (5-FU) behandelt wurden, einen offenen Chromatin-Status in der Region von Genen, die nachweislich in den mit der Reaktion assoziierten transkriptionellen Clustern, die in den scRNA-Daten identifiziert wurden, unterschiedlich exprimiert werden, wodurch eine Verbindung zwischen der Gentranskription und der epigenetischen Chromatinregulierung hergestellt wurde. Insgesamt verbindet diese Studie die klonale Dynamik mit transkriptionellen Zuständen, wodurch die Genexpression subklonaler Funktionszustände der Tumorprogression analysiert wird. Diese Analyse deckt Genexpressionszustände und Markergene auf, die mit Metastasierung und Behandlungsansprechen in Verbindung gebracht werden und die bei der weiteren Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien und Validierung im CRC eingesetzt werden könnten.