German Title: Mechanismen der Chloroquin-Resistenz bei Plasmodium falciparum

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Abstract

Malaria remains the most prevalent infectious disease in the world, with over 249 million cases and over 608 thousand deaths reported in 2022. Despite enormous efforts, two vaccines have only recently been recommended for use in a handful of countries. Therefore, malaria control has focused on vector control on the one hand, and on prophylaxis and treatment with antimalarials on the other. However, control and eradication programmes have been marked by periods of immense progress followed by lapses of stagnation and relapse. For instance, it has been almost 15 years since resistance to the artemisinins was first reported in Southeast Asia, and nearly a decade since parasites resistant to the partner drug piperaquine emerged, bringing artemisinin-based combination therapies under revision. Frequently, mutations in the Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) are responsible for partner drug resistance, hampering parasite clearance in treated patients. The protein lies in the digestive vacuole membrane of the parasite, where resistance-conferring mutations allow PfCRT to bind and expel drugs like chloroquine or piperaquine out of the vacuole, where they can no longer exert their antimalarial effects. While efforts are in parallel directed to designing new drugs and developing new vaccines, a further understanding of the mechanisms by which PfCRT handles drugs is necessary to extend the longevity of currently available antimalarials and to prevent the emergence of resistance to new drugs. This doctoral thesis studied PfCRT from the point of view of its post-translational modifications and of the mutations that it carries in chloroquine and piperaquine resistant parasites. Through the employment of proteomic approaches like the chemoproteomic profiling of kinase inhibitors ML-7 and H-89, I investigated which of the protein kinases in the parasite are responsible for phosphorylation of the Ser33 residue in the cytosolic N-terminus of PfCRT. In parallel, I employed K-CLASP, a method specifically designed to determine which protein kinase in a cellular lysate can phosphorylate a given phosphosite. Both experiments pointed at PfPKA as a candidate for post-translationally modifying PfCRT at the Ser33 residue. In this work, the recombinant expression of PfPKA was attempted in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS, and in Spodoptera frugiperda Sf9 and Sf21 cells, though the protein was found to be either not expressed or present in the insoluble fraction. Additionally, using an established heterologous expression system, Xenopus laevis oocytes, the effects of mutations H97Y, F145I, M343L and G353V on the PfCRT-mediated drug transport kinetics was studied. The findings offered an explanation to why these mutations confer resistance to the partner drug piperaquine but, in doing so, re-sensitize the parasite to chloroquine. I also probed the substrate binding cavity of PfCRT by combining substrate competition kinetics, information theory for model discrimination, graphical analyses of kinetic data, and computational docking and molecular dynamics simulations. With these, I found that chloroquine and piperaquine have separate, independent binding pockets in PfCRT, though some isoforms can have them competing for the same site. Lastly, based on the obtained results and on a suggestion to use chloroquine and piperaquine together in a combination therapy, I generated an artificial double mutant that outperformed isoforms associated with chloroquine or piperaquine resistance in terms of drug transport. I hypothesize that the protein cavity is very flexible and can evolve in ways to offer solutions to a parasite that faces varying drug challenges.

Translation of abstract (German)

Malaria ist nach wie vor die am weitesten verbreitete Infektionskrankheit der Welt. Im Jahr 2022 wurden mehr als 249 Millionen Fälle und über 608 Tausend Todesfälle gemeldet. Trotz enormer Anstrengungen wurden nur in letzter Zeit zwei Impfstoffe für den Einsatz in einer Handvoll Länder empfohlen. Daher konzentrierte sich die Malariabekämpfung bisher einerseits auf die Vektorkontrolle und andererseits auf die Prophylaxe und Behandlung mit Malariamitteln. Die Programme zur Bekämpfung und Ausrottung der Malaria waren durch Zeiten immenser Fortschritte gekennzeichnet, auf die jedoch Zeiten der Stagnation und des Rückfalls folgten. Es ist fast 15 Jahre her, dass in Südostasien zum ersten Mal eine Resistenz gegen Artemisinin festgestellt wurde, und fast ein Jahrzehnt ist vergangen, seit Parasiten aufgetaucht sind, die gegen das Partnerpräparat Piperaquin resistent sind, wodurch die auf Artemisinin basierenden Kombinationstherapien auf den Prüfstand kamen. Häufig sind Mutationen im Chloroquin-Resistenz-Transporter (PfCRT) von Plasmodium falciparum für die Resistenz gegen Partner-Medikamente verantwortlich und behindern die Beseitigung der Parasiten bei behandelten Patienten. Das Protein liegt in der Membran der Verdauungsvakuole des Parasiten, wo es nach dem Erwerb bestimmter Mutationen Medikamente wie Chloroquin oder Piperaquin bindet, und aus der Vakuole ausschleust, wo sie ihre Wirkung gegen Malaria nicht mehr entfalten können. Während parallel dazu Anstrengungen unternommen werden, um neue Medikamente zu entwerfen und neue Impfstoffe zu entwickeln, ist ein besseres Verständnis der Mechanismen, mit denen PfCRT mit Medikamenten umgeht, notwendig, um die Langlebigkeit der derzeit verfügbaren Malariamittel zu verlängern und die Entstehung von Resistenzen gegen neue Medikamente zu verhindern. Diese Doktorarbeit untersuchte PfCRT unter dem Gesichtspunkt seiner posttranslationalen Modifikationen und der Mutationen, die es in Chloroquin- und Piperaquin-resistenten Parasiten trägt. Durch den Einsatz von proteomischen Ansätzen wie dem chemoproteomischen Profiling der Kinaseinhibitoren ML-7 und H-89 untersuchte ich, welche der Proteinkinasen im Parasiten für die Phosphorylierung des Ser33-Rests im zytosolischen N-Terminus von PfCRT verantwortlich sind. Parallel dazu habe ich K-CLASP eingesetzt, eine Methode, die speziell entwickelt wurde, um festzustellen, welche Proteinkinase in einem zellulären Lysat eine bestimmte Phosphorseite phosphorylieren kann. Beide Experimente wiesen auf PfPKA als einen Kandidaten für die posttranslationale Modifizierung von PfCRT am Ser33-Rest hin. In dieser Arbeit wurde die rekombinante Expression von PfPKA in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS und in Spodoptera frugiperda Sf9- und Sf21-Zellen versucht, wobei sich herausstellte, dass das Protein entweder nicht exprimiert wurde oder in der unlöslichen Fraktion vorhanden war. Darüber hinaus wurden unter Verwendung eines etablierten heterologen Expressionssystems, Xenopus laevis Oocyten, die Auswirkungen der Mutationen H97Y, F145I, M343L und G353V auf die PfCRT-vermittelte Medikamententransportkinetik untersucht. Die Ergebnisse boten eine Erklärung dafür, warum diese Mutationen eine Resistenz gegen das Partner-Medikament Piperaquin verleihen, den Parasiten aber gleichzeitig wieder gegen Chloroquin sensibilisieren. Außerdem untersuchte ich den Substratbindungstasche von PfCRT, indem ich Substratkonkurrenzkinetik, Informationstheorie zur Modellunterscheidung, grafische Analysen kinetischer Daten und computergestützte Docking- und Molekulardynamiksimulationen kombinierte. Dabei stellte ich fest, dass Chloroquin und Piperaquin separate, unabhängige Bindungstaschen in PfCRT haben, obwohl sie bei einigen Isoformen um dieselbe Stelle konkurrieren können. Schließlich habe ich auf der Grundlage dieser Ergebnisse und einer Idee, Chloroquin und Piperaquin zusammen in einer Kombinationstherapie zu verwenden, eine künstliche Doppelmutante geschaffen, die Isoformen, die mit Chloroquin- oder Piperaquin-Resistenz assoziiert sind, in Bezug auf den Medikamententransport übertrifft. Ich stelle die Hypothese auf, dass der Proteinbindungstasche sehr flexibel ist und sich so entwickeln kann, dass er Lösungen für einen Parasiten bietet, der mit verschiedenen Medikamenten konfrontiert ist.