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Abstract

This two-part thesis explores the utility of non-viral DNA vectors for reprogramming human cells, as well as the potentiation of the oncolytic virus H-1 parvovirus (H-1PV) by a novel combination with the antiviral drug Ledipasvir.

Pluripotent stem cells are an attractive tool for regenerative medicine due to their capacity for unlimited self-renewal and their ability to differentiate into any somatic cell type. However, the generation of pluripotent stem cells from human embryos raises ethical challenges and is strictly regulated as a result. The advent of cellular reprogramming has now made it possible to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from a patient’s own cells, or for derivation of off-the-shelf cell therapies without the ethical concerns of embryonic stem cells. Nevertheless, current methods for the generation of iPSCs for clinical application cause concerns due to the use of viruses and viral components. Lentiviral transduction is a popular method to introduce reprogramming factors into cells, however they carry with them a high risk of insertional mutagenesis. iPSCs which are currently employed in a therapeutic manner in clinical trials are exclusively derived using the oriP/EBNA-1 vector system, which makes use of the Epstein Barr Virus Nuclear Antigen 1, a protein which has been implicated in oncogenesis, and is known to induce immune activation in iPSCs. Thus, there is a clear need to improve the safety of the reprogramming process to generate iPSCs with the least possible damage and immune activation. In this thesis, I show for the first time that DNA vectors which comprise Scaffold/Matrix Attachment Regions (S/MARs) can be used to reprogram healthy neonatal human dermal fibroblasts, eliminating the need for viral components. SMAR vectors are retained episomally in cells without integration, but require only a single transfection for successful reprogramming, a feature which is highly attractive for current good manufacturing practice (cGMP). SMAR iPSCs can be generated at practical efficiencies and are phenotypically indistinguishable from traditional EBNA iPSCs. They also show strong similarity to human embryonic stem cell lines in their gene expression. Importantly, SMAR iPSCs show differentiation capacity into cell of all three embryonic lineages, confirming their pluripotency. Surprisingly, modifications to the vectors to reduce their immunogenicity and improve their retention in cells proved counterproductive, as these optimised nanoSMAR vectors were unable to fully reprogram cells. The genetic stability of SMAR iPSCs is comparable to that of EBNA iPSCs, and they show the potential for loss of the vector after reprogramming to generate vector free iPSCs. Further fine-tuning of the SMAR vector system to ensure passive vector loss after reprogramming is discussed. This work thus represents a step towards virus free, vector free and factor free reprogramming for clinical applications.

The field of oncolytic virotherapy has enjoyed increasing clinical success in the past decade, with the worldwide approval of four oncolytic viruses to date. One of the oncolytic viruses under clinical evaluation is H-1PV, a rodent protoparvovirus which is non-pathogenic to humans and possesses natural oncolytic activity. Its replication is strictly dependent on a transformed phenotype in human cells, giving it a good safety profile for clinical use. This virus has shown considerable promise in early-stage clinical trials for the treatment of both high-grade glioma and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), two cancer modalities for which treatment options remain limited and prognosis is dismal. H-1PV treatment in these settings was safe and well tolerated, with some early signs of efficacy including evidence of viral replication in the tumour bed and immune conversion of the tumour microenvironment, as well as an improvement in patient survival in comparison to historical controls. Nonetheless, H-1PV monotherapy was not curative under the regimes used, highlighting a need for the improvement of oncolytic H-1PV therapy. One approach for this with rapid translational potential is the combination therapy of H-1PV with other drugs to improve its oncolytic activity. This approach has already shown promise in the successful potentiation of H-1PV in combination with the histone deacetylase inhibitor valproic acid and pro-apoptotic BH3 mimetics, such as ABT-737. Here I present a high-throughput screening approach which identified the FDA-approved antiviral drug Ledipasvir as a potentiator of H-1PV oncolysis in human cells. Importantly, Ledipasvir co-treatment improves the oncolytic capabilities of H-1PV in a wide range of cancer cell lines spanning diverse tumour types, including primary patient-derived PDAC cultures. I determined that the cell death induced by the Ledipasvir-H-1PV combination is at least in part apoptotic, but the drug is unable to improve viral replication. Instead, Ledipasvir improves the oncotoxic properties of the major effector protein NS1, albeit without directly binding to NS1. A series of unbiased screening approaches revealed a complex interplay between Ledipasvir, H-1PV, and the pro-survival PI3K/Akt/mTOR signalling pathway. While H-1PV alone activates Akt signalling, this becomes hyperactivated upon the addition of Ledipasvir, and may serve to improve the functionality of NS1. Further downstream, inhibition of mTOR by the small molecule Torin was able to abrogate the combinatorial effects of H-1PV and Ledipasvir, without affecting oncolysis by H-1PV alone. I propose a tentative model in which the combination of Ledipasvir and H-1PV modulate components of the PI3K/Akt/mTOR pathway to improve the functionality and oncotoxic capabilities of the H-1PV NS1 protein, ultimately improving viral oncolysis.

Translation of abstract (German)

Diese zweiteilige Arbeit untersucht die Verwendung nichtviraler DNA-Vektoren für die Reprogrammierung menschlicher Zellen sowie die Potenzierung der onkolytischen Eigenschaften des H-1 Parvovirus (H-1PV) durch eine neuartige Kombination mit dem antiviralen Wirkstoff Ledipasvir.

Pluripotente Stammzellen sind aufgrund ihrer Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung und ihrer Fähigkeit, sich in jeden somatischen Zelltyp zu differenzieren, ein attraktives Werkzeug für die regenerative Medizin. Die Gewinnung pluripotenter Stammzellen aus menschlichen Embryonen wirft jedoch ethische Probleme auf und ist daher streng geregelt. Seit dem Aufkommen der zellulären Reprogrammierung ist es nun möglich, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus adulten patienteneigenen Zellen oder aus patientenfremden Zellen zu erzeugen und erlauben damit gebrauchsfertige und standardisierte Zelltherapien ohne die ethischen Bedenken die mit der Nutzung embryonaler Stammzellen verbunden sind. Die derzeitigen Methoden zur Gewinnung von iPSCs für die klinische Anwendung sind jedoch aufgrund der Verwendung von Viren und viralen Komponenten risikobehaftet. Die lentivirale Transduktion ist eine beliebte Methode, um Reprogrammierungsfaktoren in die Zellen einzubringen, birgt jedoch die Gefahr der Insertionsmutagenese. iPSCs, die derzeit in klinischen Versuchen therapeutisch eingesetzt werden, werden ausschließlich mit dem oriP/EBNA-1-Vektorsystem erzeugt, das das Epstein-Barr-Virus-Nuklearantigen 1 verwendet, ein Protein, das mit Onkogenese in Verbindung gebracht wird und dafür bekannt ist, dass es in iPSCs eine Immunaktivierung auslöst. Diese Ausgangssituation verlangt nach einer sichereren Reprogrammierungsmethode, um iPSCs mit möglichst geringer Schädigung und Immunaktivierung zu generieren. In dieser Arbeit zeige ich zum ersten Mal, dass DNA-Vektoren, die Scaffold/Matrix Attachment Regions (S/MARs) enthalten, zur Reprogrammierung gesunder, neonataler, menschlicher Hautfibroblasten verwendet werden können, ohne dass virale Komponenten erforderlich sind. SMAR-Vektoren integrieren nicht ins Genom sondern verbleiben episomal in den Zellen, erfordern aber nur eine einzige Transfektion für eine erfolgreiche Reprogrammierung und sind daher ideal für die hohen Anforderungen der Arzneimittelherstellung (Good Manufacturing Practice, GMP), geeignet. SMAR iPSCs können mit praktikabler Effizienz erzeugt werden und sind phänotypisch nicht von herkömmlichen EBNA iPSCs zu unterscheiden. Auch in ihrer Genexpression weisen sie große Ähnlichkeit mit humanen embryonalen Stammzelllinien auf. Besonders hervorzuheben ist, dass SMAR-iPSCs die Fähigkeit zur Differenzierung in Zellen aller drei embryonalen Abstammungslinien aufweisen, was ihre Pluripotenz bestätigt. Überraschenderweise erwiesen sich Modifikationen an den Vektoren zur Verringerung ihrer Immunogenität und zur Verbesserung ihrer anhaltenden Präsenz in den Zellen als kontraproduktiv, da diese optimierten nanoSMAR-Vektoren nicht in der Lage waren, Zellen vollständig zu reprogrammieren. Die genetische Stabilität von SMAR iPSCs ist mit der von EBNA iPSCs vergleichbar, und sie zeigen das Potenzial, den Vektor nach der Reprogrammierung zu verlieren, was die Erzeugung vektorfreier iPSCs ermöglichen würde. Eine weitere Optimierung des SMAR-Vektorsystems, um den passiven Vektorverlust nach der Reprogrammierung sicherzustellen, ist geplant. Diese Arbeit stellt somit einen Schritt in Richtung virenfreier, vektorfreier und faktorfreier Reprogrammierung für klinische Anwendungen dar.

Der Bereich der onkolytischen Virotherapie ist in den letzten zehn Jahren zunehmend klinisch erfolgreich geworden, wobei bisher vier onkolytische Viren weltweit als Arzneimittel zugelassen wurden. Eines der in der klinischen Prüfung befindlichen onkolytischen Viren ist H-1PV, ein Nagetier-Protoparvovirus, das für den Menschen nicht pathogen ist und eine natürliche onkolytische Aktivität besitzt. Seine Replikation ist in menschlichen Zellen streng auf einen tumorartig transformierten Phänotyp begrenzt, was ihm ein gutes Sicherheitsprofil für den klinischen Einsatz verleiht. Dieses Virus hat sich in frühen klinischen Versuchen als vielversprechend für die Behandlung von hochgradigen Gliomen und duktalen Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (engl.: PDAC) erwiesen, zwei Krebsarten, für die es nach wie vor nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten gibt und deren Prognose sehr schlecht ist. Die H-1PV-Behandlung in diesen Fällen war sicher und gut verträglich, und zeigte erste Anzeichen für eine Wirksamkeit, darunter Hinweise auf virale Replikation im Tumorbett und Immunumwandlung der Tumormikroumgebung sowie eine Verbesserung der Überlebensrate der Patienten im Vergleich zu historischen Kontrollen. Dennoch war die H-1PV-Monotherapie mit den verwendeten Therapieschemata nicht kurativ, was die Notwendigkeit einer Verbesserung der onkolytischen H-1PV-Therapie unterstreicht. Ein Ansatz mit schnellem Umsetzungspotenzial ist die Kombinationstherapie von H-1PV mit anderen bereits zugelassenen Medikamenten zur Verbesserung seiner onkolytischen Aktivität. Dieser Ansatz hat sich bereits in der erfolgreichen Potenzierung der onkolytischen Eigenschaften von H-1PV in Kombination mit dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Valproinsäure und pro-apoptotischen BH3-Mimetika wie ABT-737 als vielversprechend erwiesen. Hier stelle ich einen Hochdurchsatz-Screening-Ansatz vor, mit dem das von der FDA zugelassene antivirale Medikament Ledipasvir als Verstärker der H-1PV-Onkolyse in menschlichen Zellen identifiziert wurde. Die gleichzeitige Behandlung mit Ledipasvir verbessert die onkolytischen Fähigkeiten von H-1PV in einem breiten Spektrum von Krebszelllinien verschiedener Tumorarten, einschließlich primärer PDAC-Kulturen, die von Patienten stammen. Ich habe herausgefunden, dass der durch die Ledipasvir-H-1PV-Kombination ausgelöste Zelltod zumindest teilweise apoptotisch ist, das Medikament aber nicht in der Lage ist, die virale Replikation zu verbessern. Stattdessen fördert Ledipasvir die onkotoxischen Eigenschaften des Haupteffektorproteins NS1, ohne jedoch direkt an NS1 zu binden. Eine Reihe von Screening-Ansätzen ergab ein komplexes Zusammenspiel zwischen Ledipasvir, H-1PV und dem überlebensfördernden PI3K/Akt/mTOR-Signalweg. Während H-1PV allein den Akt-Signalweg aktiviert, wird dieser bei Zugabe von Ledipasvir hyperaktiviert und kann dazu dienen, die Funktionalität von NS1 zu verbessern. Die Hemmung von mTOR durch den small-molecule Inhibitor Torin konnte die kombinatorischen Effekte von H-1PV und Ledipasvir aufheben, ohne die Onkolyse durch H-1PV allein zu beeinflussen. Ich schlage ein vorläufiges Modell vor, bei dem die Kombination von Ledipasvir und H-1PV Komponenten des PI3K/Akt/mTOR-Stoffwechsels moduliert, um die Funktionalität und die onkotoxischen Fähigkeiten des NS1-Proteins von H-1PV zu verbessern, was letztendlich die virale Onkolyse steigert.