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Abstract

Cellular senescence describes the state of a stable cell proliferation arrest. The cell cycle arrest is triggered by various endogenous and exogenous stressors including telomere shortening, DNA damage, oxidative stress, cytotoxic drugs, and oncogene activation among others. Replicative senescence (RS) occurs in ageing cells to impede unlimited proliferation. Further, in normal somatic cells, the activation of oncogenes can induce transformation to cancerous cells. However, by entering the premature senescent state cells avoid to undergo transformation. Hence, cellular senescence functions as a barrier to transformation and is a failsafe mechanism to protect the organism from potentially damaged and dangerous cells by enforcing their cell cycle arrest. The type of senescence initiated through oncogenes such as RASG12V and BRAFV600E is defined as oncogene-induced senescence (OIS). Following, senescent cells evoke the senescence-associated secretory phenotype (SASP) composed of signalling molecules including cytokines and lipid mediators. In contrast to the anti-inflammatory molecules, the pro-inflammatory side of the SASP can promote cell transformation and tumour growth. In order to further understand metabolic alterations associated with senescence induction and to find vulnerabilities of OIS cells, I aimed to investigate the transcriptome, metabolome, and lipidome of BRAFV600E-expressing human diploid fibroblasts in a time-resolved manner. First, I could describe increased tricarboxylic acid (TCA) cycle activity as well as pyruvate anaplerosis in oncogenic BRAFV600E-induced senescent cells. Furthermore, these data revealed that the serine synthesis pathway (SSP) was impaired upon senescence. Especially, the rate limiting enzyme of the SSP phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH) was strongly downregulated. Overexpression of PHGDH in BRAFV600E-expressing fibroblasts resulted in reduced senescence capacity, while PHGDH expression itself was not sufficient to overcome OIS. Next, the exposure of a panel of melanoma cell lines to serine and glycine deprived medium and its combination with a PHGDH inhibitor treatment revealed different dependencies on exogenous serine or de novo serine synthesis in melanoma. Secondly, comprehensive metabolic and transcriptomic profiling exposed the lipid metabolism as widely altered metabolic process upon OIS. Therefore, I conducted a full lipidome profile of OIS cells in a time-resolved manner. Intriguingly, the neutral lipid class of triacylglycerides (TAGs) was highly accumulated in senescent cells over time. TAGs are fatty acid (FA)-containing lipids stored in lipid droplets (LDs) and can be utilised as main energy source. TAG synthesis is mainly conducted by diacylglycerol O-acyltransferase 1 and 2 (DGAT1/2), latter one was upregulated upon OIS. LDs have been discussed to protect against oxidative stress and lipid peroxidation by sequestering polyunsaturated FAs (PUFAs) in form of TAGs. The accumulation of lipid peroxides in PUFA-phospholipids in cellular membranes can drive ferroptosis, an iron-dependent form of non-apoptotic cell death. Reduced lipid peroxidation and increased levels of specific long chain-PUFA-containing TAGs explained the observed ferroptosis resistance in OIS. DGAT inhibition increased ferroptosis susceptibility and lipid peroxidation in senescent cells. Additionally, the abundance of TAGs consisting of highly unsaturated long acyl-chains was reduced upon DGAT treatment, whereas the abundance of PUFAs in the membrane phospholipids phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) was elevated. Overall, I discovered that OIS cells have an elevated TAG synthesis which protects senescent cells from ferroptosis. Also, inhibition of DGAT prevents TAG formation and restores ferroptosis sensitivity by channelling PUFAs into membrane lipids. Concluding, I could demonstrate that remodelling of the cellular lipidome contributes to ferroptosis resistance of senescent cells. Additionally, by generating a total FA profile I identified the ω-6 PUFA arachidonic acid (AA) as strongly diminished in OIS cells. AA serves as a substrate for eicosanoid biosynthesis. Eicosanoids are diverse signalling molecules which are important modulators of inflammation and immune response. AA for eicosanoid synthesis can be generated by cleavage from membrane phospholipids. Further analysis revealed augmented activity of the AA metabolism including elevated expression of the phospholipase A2 group IVA (PLA2G4A) and cyclooxygenase 2 (COX2; PTGS2) in senescent cells in order to drive increased secretion of oxylipins. It has been shown that inhibition of DGAT can redirect PUFAs from TAGs into phospholipids. Thereby, inhibition of DGAT further induced oxylipin production in OIS cells. In addition, DGAT inhibition influenced the senescence phenotype and reduced cell cycle arrest markers but did not drive proliferation of senescent cells. Overall, my findings demonstrate the importance of understanding metabolic mechanisms, especially lipid metabolism, in a highly metabolically active system as senescence. They also suggest new combinatorial treatment strategies to antagonise the harmful state of senescence and to open up new concepts to combat cancerous cells.

Translation of abstract (German)

Zelluläre Seneszenz beschreibt den Zustand eines stabilen Zellproliferationsarrests. Der Zellzyklusarrest wird durch verschiedene endogene und exogene Stressfaktoren ausgelöst, darunter Telomerverkürzung, DNA-Schäden, oxidativer Stress, zytotoxische Medikamente und onkogene Aktivierung. Replikative Seneszenz (RS) tritt in alternden Zellen auf, um die unbegrenzte Proliferation aufzuhalten. Darüber hinaus kann in normalen somatischen Zellen die Aktivierung von Onkogenen eine Umwandlung zu krebsartigen Zellen induzieren, jedoch verhindern Zellen durch den Eintritt in die vorzeitige Seneszenz diese Transformation. Demzufolge fungiert zelluläre Seneszenz als Transformationsbarriere und Schutzmechanismus, der den Organismus durch den Eintritt in den Zellzyklusarrest vor geschädigten und potentiell gefährlichen Zellen schützt. Die durch Onkogene wie RASG12V und BRAFV600E initiierte Art von Seneszenz wird als Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS) bezeichnet. Seneszente Zellen rufen den Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) hervor, der aus Signalmolekülen wie Zytokinen und Lipidmediatoren besteht. Im Gegensatz zu den anti-inflammatorischen Molekülen kann die pro-inflammatorische Seite des SASP die Zelltransformation und das Tumorwachstum fördern. Um die mit der Seneszenzinduktion assoziierten metabolischen Veränderungen genauer zu verstehen und Schwachstellen der OIS-Zellen aufzudecken, erforschte ich zeitaufgelöst das Transkriptom, Metabolom und Lipidom von BRAFV600E-exprimierenden humanen diploiden Fibroblasten. Zunächst konnte ich eine erhöhte Aktivität des Tricarbonsäurezyklus (TCA) sowie eine Pyruvat-Anaplerose in onkogenen BRAFV600E-induzierten seneszenten Zellen beschreiben. Zudem verdeutlichten diese Daten, dass der Serinsyntheseweg (SSP) bei Seneszenz beeinträchtigt und insbesondere das ratenlimitierende Enzym Phosphoglycerat Dehydrogenase (PHGDH) stark herunterreguliert war. Die Überexpression von PHGDH in BRAFV600E-exprimierenden Fibroblasten führte zu einer reduzierten Seneszenzfähigkeit, während die PHGDH Expression selbst nicht ausreichte, um OIS zu überwinden. Die Kultivierung von Melanomzelllinien in einem Serin- und Glycin entzogenem Medium und dessen Kombination mit einer PHGDH-Inhibitor Behandlung zeigte unterschiedliche Abhängigkeiten von exogenem Serin oder der de novo Serinsynthese im Melanom. Zweitens ergab eine umfassende metabolische und transkriptomische Profilerstellung, dass der Lipidmetabolismus bei OIS stark verändert war. Demzufolge erstellte ich ein vollständiges, zeitaufgelöstes Lipidomprofil von OIS-Zellen. Interessanterweise akkumulierte im Laufe der Zeit in den seneszenten Zellen die neutrale Lipidklasse der fettsäurehaltigen Triacylglyceride (TAGs), die in Lipidtröpfchen (LDs) gespeichert und als Hauptenergiequelle genutzt werden können, stark. Die TAG-Synthese wird hauptsächlich von Diacylglycerol-O-Acyltransferase 1 und 2 (DGAT1/2) durchgeführt, wobei letztere bei OIS hochreguliert war. Es wurde diskutiert, dass LDs vor oxidativem Stress und Lipidperoxidation schützen, indem sie mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) in Form von TAGs aufnehmen. Die Anhäufung von Lipidperoxiden in PUFA-Phospholipiden in Zellmembranen kann Ferroptose, eine eisenabhängige Form des nicht-apoptotischen Zelltods, auslösen. Reduzierte Lipidperoxidation und erhöhter Gehalt an insbesondere langkettigen PUFA-haltigen TAGs erklärten die beobachtete Ferroptoseresistenz bei OIS. Die DGAT-Inhibition erhöhte die Ferroptoseanfälligkeit und die Lipidperoxidation in seneszenten Zellen. Darüber hinaus verringerte sich die Abundanz der aus hochgradig ungesättigten langen Acylketten bestehenden TAGs durch die DGAT-Behandlung, wohingegen die Abundanz der PUFAs in den Membranphospholipiden Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) zunahm. Insgesamt stellte ich fest, dass OIS-Zellen eine erhöhte TAG-Synthese aufweisen, die seneszente Zellen vor Ferroptose schützt. Außerdem verhindert die DGAT-Inhibition die TAG-Bildung und stellt die Ferroptosesensitivität wieder her, indem PUFAs in die Zellmembran geleitet werden. Abschließend konnte ich demonstrieren, dass die Remodellierung des zellulären Lipidoms zur Ferroptoseresistenz seneszenter Zellen beiträgt. Zusätzlich identifizierte ich anhand der Erstellung eines Fettsäureprofils, dass die ω-6 PUFA Arachidonsäure (AA) in OIS-Zellen stark vermindert war. AA dient als Substrat für die Biosynthese von Eicosanoiden. Eicosanoide sind vielfältige Signalmoleküle, die die Regulierung von Entzündungen und Immunreaktionen maßgeblich beeinflussen. AA kann für die Eicosanoidsynthese durch Abspaltung von Membranphospholipiden generiert werden. Weitere Analysen ergaben eine gesteigerte Aktivität des AA-Metabolismus mit erhöhter Expression der Phospholipase A2 Gruppe IVA (PLA2G4A) sowie der Cyclooxygenase 2 (COX2; PTGS2) in seneszenten Zellen, um die vermehrte Sekretion von Oxylipinen anzutreiben. Wie bereits gezeigt, kann die DGAT-Inhibition PUFAs von TAGs zu Phospholipiden umleiten und eine weitere Induktion der Oxylipinproduktion in OIS-Zellen bewirken. Darüber hinaus beeinflusste die DGAT-Inhibition den Seneszenzphänotypen und reduzierte die Zellzyklusarrestmarker, führte jedoch nicht zur Proliferation seneszenter Zellen. Zusammenfassend demonstrieren meine Ergebnisse die Relevanz für das tiefere Verständnis metabolischer Mechanismen, insbesondere des Lipidmetabolismus, in einem hochgradig stoffwechselaktiven System wie der Seneszenz. Sie empfehlen zudem neue kombinatorische Behandlungsstrategien, um dem schädlichen Zustand der Seneszenz entgegenzuwirken und neue Konzepte zur Bekämpfung von Krebszellen zu erschließen.