German Title: Untersuchung der Biologie heterogener hämatopoetischer Stammzellen in homöostatischen und krankheitsassoziierten Zuständen

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Abstract

The hematopoietic stem cell (HSC) compartment is considered heterogeneous at both functional and molecular levels in its ability to continuously generate all mature blood cells throughout life. With age, clonal hematopoiesis can develop, where an HSC clone disproportionally contributes to the blood cell lineages. This phenomenon has been associated with an increased risk of various diseases.

In the first part of this dissertation, I utilized single cell transplantations and mathematical modeling to interrogate the functional potency of individual HSCs and their paired progeny, and assess cell-extrinsic mechanisms modulating the functionality of HSCs. A large-scale comprehensive analysis of single HSC transplants revealed reconstitution kinetics as a novel parameter capable of predicting HSC transplantation outcomes. My data demonstrated a significant correlation between slower reconstitution kinetics and stemness, alongside a “myeloid-biased” behavior. Conversely, fast-reconstituting clones exhibited exhaustion patterns and classical “lymphoid-biased” outputs. Secondary transplantations of single daughter HSCs revealed a profound decline in functional potential compared to their parent HSC. Moreover, daughter HSC clones acquired faster reconstitution kinetics, correlating with loss of sustained myelopoiesis, and overall HSC potency. Mathematical modeling of single cell transplantation outcomes led to the identification of cell-extrinsic feedback mechanisms regulating the activity of individual HSCs. These data highlighted that the functional outcome of a single HSC is, in part, influenced by the activity of the surrounding HSCs, unlike assumptions of intrinsic programs solely governing HSC heterogeneity. This finding was experimentally validated by altering the single cell transplantation scheme, so that the single HSC was surrounded by lymphoid-deficient Rag2-/- cells. Slow and rapid engraftment kinetics could still be detected, indicating that repopulation dynamics are mostly an intrinsic feature of the HSC clone. However, I no longer observed canonical “myeloid-biased” outcomes, denoting that, on the contrary, lineage output of single HSCs is highly dependent on that of neighboring clones.

In the second part of my dissertation, I investigated the role of Tet2 clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP) on the evolution of hepatocellular carcinoma (HCC) with a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) etiology, with the underlying hypothesis that Tet2 CHIP is as a risk factor for this disease. Dietary-induced HCC represents the fastest rising cancer in the western world, predominantly affecting the elderly population. This disease frequently evolves from an advanced stage of NAFLD, which is primarily characterized by chronic liver inflammation driven by infiltrating-hematopoietic cells. In this project, I employed a mouse model of Tet2-driven CHIP, combined with the administration of a high caloric “Western diet”, able to induce liver damage and faithfully recapitulate the sequential evolution of NAFLD and HCC observed in humans. Long-term assessment of disease progression demonstrated a synergistic effect when combining a Western diet and Tet2 CHIP. This was evidenced by increased serum levels of the biomarkers alanine and aspartate aminotransferases (ALT, AST), higher histopathological NAFLD assessment score (NAS), and a higher incidence of transition to HCC from premalignant stages. Molecular characterization of Western diet liver homogenates further confirmed this synergy, revealing higher degree of fibrosis, inflammation and dysregulated metabolism in Tet2 CHIP livers compared to wild type (WT) counterparts. To this end, a substantial part of my thesis focused on elucidating the mechanisms via which Tet2 CHIP contributes to HCC development. A combination of functional and molecular analysis, including scRNA-seq, bulk RNA-seq and metabolomics, have revealed synergistic programs in Tet2 CHIP Western diet mice.

Taken together, this dissertation advances the field of hematology from two angles; homeostatic and disease. It provides a comprehensive understanding on HSC heterogeneity using large-scale and fine experimental approaches and mathematical modeling. Additionally, it identifies Tet2 CHIP as a potential risk factor for diet-induced liver cancer, offering mechanistic insights which could be exploited for therapeutic interventions.

Translation of abstract (German)

Das Kompartiment der hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) gilt sowohl auf funktioneller als auch auf molekularer Ebene als heterogen in seiner Fähigkeit, während des gesamten Lebens kontinuierlich alle reifen Blutzellen zu erzeugen. Mit zunehmendem Alter kann sich eine klonale Hämatopoese entwickeln, bei der ein HSZ-Klon überproportional zu den Blutzelllinien beiträgt. Dieses Phänomen wurde mit einem erhöhten Risiko für verschiedene Krankheiten in Verbindung gebracht.

Im ersten Teil dieser Dissertation habe ich Einzelzelltransplantationen und mathematische Modellierung eingesetzt, um die funktionelle Potenz einzelner HSZ und ihrer gepaarten Nachkommen zu untersuchen und zellexterne Mechanismen zu bewerten, die die Funktionalität von HSZ modulieren. Eine groß angelegte umfassende Analyse einzelner HSZ-Transplantationen ergab die Rekonstitutionskinetik als neuen Parameter, der die Ergebnisse von HSZ-Transplantationen vorhersagen kann. Meine Daten zeigten eine signifikante Korrelation zwischen einer langsameren Rekonstitutionskinetik und Stammzellen, sowie einem "myeloiden" Verhalten. Umgekehrt zeigten schnell rekonstituierende Klone Erschöpfungsmuster und klassische "lymphoid-lastige“ Ergebnisse. Bei der sekundären Transplantation einzelner Tochter-HSZ zeigte sich ein starker Rückgang des funktionellen Potenzials im Vergleich zu den Eltern-HSZ. Darüber hinaus wiesen die Tochter-HSZ-Klone eine schnellere Rekonstitutionskinetik auf, die mit dem Verlust einer anhaltenden Myelopoese und der allgemeinen HSZ-Potenz korrelierte. Die mathematische Modellierung der Ergebnisse der Einzelzelltransplantation führte zur Identifizierung zellexterner Rückkopplungsmechanismen, die die Aktivität der einzelnen HSZ regulieren. Diese Daten machten deutlich, dass das funktionelle Ergebnis einer einzelnen HSZ zum Teil von der Aktivität der sie umgebenden HSZ beeinflusst wird, im Gegensatz zu der Annahme, dass intrinsische Programme allein ausschlaggebend sind. Dieser Befund wurde experimentell bestätigt, indem das Schema der Einzelzelltransplantation dahingehend geändert wurde, dass die einzelnen HSZ von lymphoid-defizienten Rag2-/- Zellen umgeben waren. Die langsame und schnelle Einwanderungskinetik konnte immer noch festgestellt werden, was darauf hindeutet, dass die Repopulationsdynamik hauptsächlich ein intrinsisches Merkmal des HSZ-Klons ist. Allerdings beobachtete ich keine kanonischen "myeloiden" Ergebnisse mehr, was darauf hindeutet, dass die Abstammung einzelner HSZ stark von den benachbarten Klonen abhängt.

Im zweiten Teil meiner Dissertation untersuchte ich die Rolle der klonalen Tet2-Hämatopoese mit unbestimmtem Potenzial (CHIP) bei der Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) mit einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), mit der zugrundeliegenden Hypothese, dass Tet2 CHIP als Risikofaktor für diese Krankheit fungieren könnte. Das ernährungsbedingte HCC ist die am schnellsten wachsende Krebserkrankung in der westlichen Welt und betrifft vor allem die ältere Bevölkerung. Diese Krankheit entwickelt sich häufig aus einem fortgeschrittenen Stadium der NAFLD, die in erster Linie durch eine chronische Leberentzündung gekennzeichnet ist, die durch infiltrierende hämatopoetische Zellen angetrieben wird. In diesem Projekt habe ich ein Tet2 CHIP Mausmodell verwendet, das in Verbindung mit einer hochkalorischen "westlichen Diät" in der Lage ist, Leberschäden hervorzurufen und die beim Menschen beobachtete sequentielle Entwicklung von NAFLD und HCC getreu zu rekapitulieren. Die Langzeitbeurteilung des Krankheitsverlaufs zeigte einen synergistischen Effekt bei der Kombination einer westlichen Diät und Tet2 CHIP. Dies wurde durch erhöhte Serumspiegel der Biomarker Alanin- und Aspartat-Aminotransferasen (ALT, AST), einen höheren histopathologischen NAFLD-Bewertungsscore (NAS) und eine höhere Inzidenz des Übergangs von prämalignen Stadien zu HCC belegt. Die molekulare Charakterisierung von Leberhomogenaten aus westlicher Ernährung bestätigte diese Synergie weiter und zeigte ein höheres Maß an Fibrose, Entzündung und dysreguliertem Stoffwechsel in Tet2 CHIP-Lebern im Vergleich zu Wild Typ (WT)-Lebern. Aus diesem Grund fokussierte sich ein wesentlicher Teil meiner Arbeit auf die Aufklärung der Mechanismen, über die Tet2 CHIP zur Entwicklung von HCC beiträgt. Eine Kombination aus funktioneller und molekularer Analyse, einschließlich scRNA-seq, Bulk-RNA-seq und Metabolomik, hat synergistische Programme in Tet2 CHIP-Mäusen mit westlicher Ernährung aufgedeckt.

Insgesamt bringt diese Dissertation das Feld der Hämatologie aus zwei Blickwinkeln voran: Einerseits liefert sie ein umfassendes Verständnis der Heterogenität von HSZ mit Hilfe groß angelegter und feiner experimenteller Ansätze und mathematischer Modellierung. Darüber hinaus wird Tet2 CHIP als potenzieller Risikofaktor für ernährungsbedingten Leberkrebs identifiziert und bietet mechanistische Erkenntnisse, die für therapeutische Interventionen genutzt werden könnten.