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Abstract

Understanding cellular processes at the molecular level is fundamental for gaining insights into biological mechanisms and their implications in health and disease. Fluorescent biosensors have emerged as powerful tools in this regard, as they enable real-time monitoring of these processes with high spatiotemporal resolution using live-cell imaging. Despite significant progress in the development of biosensors, limitations still exist. While intensiometric biosensors often exhibit large dynamic ranges, they are susceptible to changes in sensor concentration and photobleaching, potentially resulting in skewed experimental results. In contrast, ratiometric FRET-based biosen-sors offer a more robust quantification, but often suffer from a low dynamic range and occupy a substantial part of the spectral space, hindering their multiplexing capability with other fluorescent tools. To address these limitations, I developed a chemogenetic FRET system called ChemoX, based on a fluorescent protein FRET donor and rhodamine-based FRET acceptor, which is conjugated to the self-labeling protein HaloTag7. Engineering of a specific interface between the fluorescent protein and HaloTag7, enabled the generation of high efficiency FRET pairs. The spectral prop-erties of ChemoX can be modified by either replacing the FRET donor with a fluorescent protein of different color, or by labeling HaloTag7 with spectrally distinct fluorophores, all while ensuring that a high FRET efficiency is maintained. The utilization of FRET pairs with large spectral sep-aration combined with the ability to fine-tune their FRET efficiency, allowed for the generation of ChemoX biosensors with different colors and large dynamic ranges. I demonstrated the gener-alizability of this approach by developing biosensors for Ca2+, ATP and NAD+ with improved dynamic ranges compared to established FRET-based biosensors. Furthermore, the increased multiplexing capacity of ChemoX sensors enabled real-time monitoring of free NAD+ at different subcellular localizations within the same cell, representing a valuable addition to existing tools for the investigation of compartmentalized NAD+ dynamics. Moreover, I leveraged the ChemoX interface to modulate the fluorescence intensity of bright rho-damine-based fluorophores and develop single-channel fluorescence lifetime-based ChemoX sensors with far-red emission wavelengths. The spectral properties of these sensors hold promise for their use in in vivo applications. Finally, I generated bioluminescent ChemoX biosensors through simple fusion of the luciferase NanoLuc to the N-terminus of fluorescent ChemoX bio-sensors and demonstrated their compatibility for high-throughput screenings using microplate reader systems. In summary, I developed a versatile chemogenetic system that allows for the development of bio-sensors with large dynamic ranges and spectral flexibility, providing the scientific community with a complemented toolbox for the investigation of important cell metabolites.

Translation of abstract (German)

Das Verständnis zellulärer Prozesse auf molekularer Ebene ist von grundlegender Bedeutung, um Einblicke in biologische Mechanismen und deren Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit zu gewinnen. Fluoreszierende Biosensoren haben sich in dieser Hinsicht als leistungsfähige Werk-zeuge erwiesen, da sie die Echtzeitüberwachung dieser Prozesse mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen. Trotz erfolgreicher Fortschritte bei der Biosensorik gibt es immer noch Einschränkungen. Während intensiometrische Biosensoren oft einen großen dynamischen Bereich aufweisen, sind sie anfällig für Veränderungen der Sensorkonzentration und Photobleichen, was zu verzerrten experimentellen Ergebnissen führen kann. Im Gegensatz dazu bieten ratiometrische FRET-basierte Biosensoren eine robustere Quantifizierung, leiden aber oft unter geringen dynamischen Bereichen und hohem spektralen Bedarf, was ihre Multiplexfähigkeit mit anderen fluoreszenten Werkzeugen einschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, habe ich ein chemogenetisches FRET-System namens ChemoX entwickelt, das auf einem fluoreszenten Protein FRET-Donor und einem Rhoda-min-basierten FRET-Akzeptor beruht, der mit dem selbstmarkierenden Protein HaloTag7 kon-jugiert ist. Durch die Entwicklung einer spezifischen Interaktionsoberfläche zwischen dem fluo-reszenten Protein und HaloTag7 konnte ich hocheffiziente FRET-Paare erzeugen. Die spektralen Eigenschaften des chemogenetischen FRET-Paares können durch genetische Substitution mit andersfarbigen fluoreszenten Proteinen und durch Markierung von HaloTag7 mit verschiedenen Fluorophoren angepasst werden, wobei die hohe FRET-Effizienz erhalten bleibt. Die Verwen-dung von FRET-Paaren mit großem spektralen Abstand in Verbindung mit der Möglichkeit, ihre FRET-Effizienz fein abzustimmen, ermöglichte die Herstellung einer Farbpalette von ChemoX-Biosensoren mit großen dynamischen Bereichen. Ich habe gezeigt, dass dieser Ansatz verallgemeinert werden kann, indem ich Biosensoren für Ca2+, ATP und NAD+ entwickelt habe, die im Vergleich zu etablierten FRET-basierten Biosensoren verbesserte dynamische Bereiche aufweisen. Darüber hinaus ermöglichte die erhöhte Multiplexing-Kapazität der ChemoX-Sensoren die Echtzeit-Überwachung von freiem NAD+ an verschiedenen subzellulären Lokalisationen innerhalb derselben Zelle, was eine wertvolle Ergänzung zu den bestehenden Werkzeugen für die Untersuchung der Kompartmentierung von NAD+ Konzentrationen darstellt. Des Weiteren habe ich die Interkationen in ChemoX genutzt, um die Fluoreszenzintensität von hellen Rhodamin-basierten Fluorophoren zu modulieren. Dies erlaubte die Entwicklung von Sensoren mit langen Emissionswellenlängen, dessen Fluoreszenzlebenszeit genutzt werden konnte um biologische Prozesse zu überwachen. Die spektralen Eigenschaften dieser Sensoren sind vielversprechend für den Einsatz in in vivo-Anwendungen. Abschliessend habe ich biolumineszente Biosensoren durch eine Fusion der Luciferase NanoLuc mit dem N-Terminus von ChemoX-Biosensoren hergestellt und ihre Kompatibilität für Hochdurchsatz-Screenings mit Mikroplatten-Lesesystemen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich ein vielseitiges chemogenetisches System entwickelt habe, das die Entwicklung von Biosensoren mit einem großen dynamischen Bereich und einer großen spektralen Flexibilität ermöglicht und der wissenschaftlichen Gemeinschaft einen vielseitigen Werkzeugkasten für die Untersuchung wichtiger Zellmetaboliten an die Hand gibt.