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Abstract

Gene regulation is the result of the combined action of activators and repressors through a network of transcription factors (TFs) that bind to multiple enhancers, contained within topologically associating domains (TADs). Due to the high complexity of these systems, which contain many regulatory elements (including multiple enhancers, insulators, promoters) and highly interacting components in a multi-level organization, it is challenging to assess the molecular function of TFs, and how they interact with each other and with different regulatory elements, to give rise to cellular phenotypes. In my thesis, I employed perturbation approaches (in both cis and trans) to disentangle the contributions of individual TFs and regulatory elements to genome architecture and transcriptional output. In my first project, I focused on the mesoderm gene regulatory network (GRN), i.e. the ensemble of TFs, enhancers and their connections responsible for the development of the D. melanogaster mesoderm. Mesodermal enhancers show extensive time- and tissue- specific co-binding of the TFs Twist (Twi), and of its direct targets Tinman (Tin) and Myocyte enhancer factor 2 (Mef2). By depleting each factor at the precise stages when they drive mesoderm specification and differentiation, and applying single-cell ATAC-seq, I assessed the effect of time-specific depletion on cell identity, and determined the enhancers and target genes most involved in the maintenance of the correct developmental trajectory. This revealed new relationships between different TFs that co-bind to mesodermal enhancers, in addition to an exciting discovery that one mutant leads to a conversion of cell fates across germ layers, from mesoderm to ectoderm/neuronal-like fate, which is extremely rare. In my second project, I examined the elements contributing to the formation of TAD boundaries. In Drosophila, TAD boundaries have multiple insulator proteins binding in combination, and they generally coincide with transcriptional and epigenetic domains. Therefore, whether boundaries have intrinsic features driving their function, or if they result exclusively from the context, remained unclear. By inserting a selection of endogenous boundaries in ectopic locations inside other TADs, we showed that most boundaries had an effect, often orientation- or context- dependent, proving that boundaries have intrinsic features, but require contextual elements to function. Their orientation specificity implied that directional elements like promoters or motifs are required for boundary function, and that they need to be present on both sides, i.e. in both boundaries, to make a functioning pair. Since motifs of known insulators or promoters could not explain boundary pairing, I uncovered a set of conservation-based motif pairs that are associated with working boundary pairs with > 90% specificity and present at nearly 50% of endogenous genome-wide boundaries. This motif set includes known insulator motifs and motifs for TFs previously not associated with boundary function, in addition to new motifs with unknown binding proteins. The motifs in each pair have a preferred orientation, and many are convergent or divergent. This goes against the current dogma for how Drosophila TADs are formed, and suggests that the presence of oriented motifs for insulator proteins is a conserved feature to create functional boundary pairs from flies to humans. In summary, using perturbation-based approaches, I could contribute to our functional understanding of two diverse, complex systems: I directly assessed the impact of single TFs to enhancer state, TF interactions, and their connection to cellular phenotype within the mesoderm GRN. We could also provide a new perspective on the logic governing what it takes to make a functioning TAD boundary pair in Drosophila, converging on the model of boundary formation through oriented motif pairs from mammals to Drosophila.

Translation of abstract (German)

Die Genregulation ist das Ergebnis der kombinierten Wirkung von Aktivatoren und Repressoren durch ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren (TF), die an mehrere Enhancer binden, die innerhalb topologisch assoziierender Domänen (TADs) enthalten sind. Aufgrund der hohen Komplexität dieser Systeme, die viele regulatorische Elemente (einschließlich mehrerer Enhancer, Isolatoren, Promotoren) und stark interagierende Komponenten in einer mehrstufigen Organisation enthalten, ist es herausfordernd, die molekulare Funktion von TF zu bewerten und wie sie miteinander und mit verschiedenen regulatorischen Elementen interagieren, um zelluläre Phänotypen hervorzubringen. In meiner Dissertation habe ich als Ansatz Störungen (sowohl in cis als auch in trans) eingesetzt, um die Beiträge einzelner TF und regulatorischer Elemente zur Genomarchitektur und zum transkriptionellen Output zu entwirren. In meinem ersten Projekt konzentrierte ich mich auf das mesodermale genregulatorische Netzwerk (GRN), d. h. das Ensemble der TF, Enhancer und ihr Zusammenspiel, das verantwortlich ist für die Entwicklung des Mesoderms in D. melanogaster. Mesodermale Enhancer zeigen umfangreiches zeit- und gewebespezifisches simultanes Binden der TF Twist (Twi) sowie seiner direkten Ziele Tinman (Tin) und Myocyte enhancer factor 2 (Mef2). Durch Depletion jedes Faktors in den präzisen Stadien, in denen sie die Spezifikation und Differenzierung des Mesoderms vorantreiben, und durch Anwendung von Single-Cell ATAC-Seq habe ich die Auswirkung der zeitlich spezifischen Depletion auf die Zellidentität bewertet und die Enhancer und Zielgene bestimmt, die hauptsächlich an der Aufrechterhaltung der korrekten Entwicklungsablaufs beteiligt sind. Dies offenbarte neue Beziehungen zwischen den verschiedenen TF, die an mesodermale Enhancern binden, sowie eine aufregende Entdeckung, dass eine Mutation zu einer Umwandlung von Zellschicksalen über Keimschichten hinweg führt, von Mesoderm zu einem ektodermalen/neuronalen Schicksal, was äußerst selten ist. In meinem zweiten Projekt untersuchte ich die Elemente, die zur Bildung von TAD-Grenzen beitragen. In Drosophila haben TAD-Grenzen mehrere Isolatorproteine, die in Kombination binden, und sie fallen im Allgemeinen mit transkriptionellen und epigenetischen Domänen zusammen. Daher blieb unklar, ob Grenzen immanente Merkmale aufweisen, die ihre Funktion vorantreiben, oder ob sie ausschließlich aus dem Kontext resultieren. Durch Einfügen einer Auswahl endogener Grenzen an ektope Standorte innerhalb anderer TAD zeigten wir, dass die meisten Grenzen eine Wirkung hatten, die oft von der Orientierung oder dem Kontext abhängig war, was bewies, dass Grenzen immanente Merkmale haben, aber kontextabhängige Elemente benötigen, um zu funktionieren. Ihre Orientierungsspezifität deutete darauf hin, dass gerichtete Elemente wie Promotoren oder Motive für die Grenzfunktion erforderlich sind und dass sie auf beiden Seiten, d. h. in beiden Grenzen, vorhanden sein müssen, um ein funktionierendes Paar zu bilden. Da Motive bekannter Isolatoren oder Promotoren die Paarbildung von Grenzen nicht erklären konnten, identifizierte ich einen Satz von Motiven basierend auf Konservation, die mit funktionierenden Grenzpaaren mit einer Spezifität von > 90 % assoziiert und an fast 50 % der endogenen genomweiten Grenzen vorhanden sind. Dieser Satz an Motiven umfasst bekannte Isolatormotive und Motive für TF, die zuvor nicht mit der Grenzfunktion in Verbindung gebracht wurden, sowie neue Motive mit unbekannten Bindungsproteinen. Die Motive in jedem Paar haben eine bevorzugte Orientierung, und viele sind konvergent oder divergent. Dies widerspricht dem aktuellen Dogma, wie Drosophila-TAD gebildet werden, und legt nahe, dass die Anwesenheit orientierter Motive für Isolatorproteine ein konserviertes Merkmal ist, um funktionale Paare von Grenzen von Fliegen bis Menschen zu schaffen. Zusammenfassend konnte ich mit Ansätzen, die auf Störungen basieren, zu unserem funktionalen Verständnis zweier unterschiedlicher, komplexer Systeme beitragen: Ich habe direkt den Einfluss einzelner TFs auf den Status von Enhancern, TF-Interaktionen und deren Verbindung zum zellulären Phänotyp innerhalb des mesodermalen GRN bewertet. Wir konnten auch eine neue Perspektive auf die Logik geben, die erforderlich ist, um ein funktionierendes TAD-Grenzpaar in Drosophila zu bilden, in Übereinstimmung mit einem Modell für die Grenzbildung durch orientierte Motivpaare von Säugetieren bis Drosophila.