German Title: Epigenetische Deregulierung durch onkogene BCOR-Fusionen in Sarkomen

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Abstract

Sarcomas are a heterogeneous group of mesenchymal tumours arising in bone and soft tissue with a higher incidence in children and young adults. Owing to sarcomas’ molecular diversity and lack of available experimental models, progress in treatment has stagnated in the past 5 decades. Many sarcomas arise due to translocations that fuse transcriptional and epigenetic regulators, resulting in characteristic transcriptional landscapes. A commonly affected target is BCL6 co-repressor (BCOR), a member of the non-canonical Polycomb repressive complex 1.1 (ncPRC1.1) which promotes gene silencing by ubiquitinating lysine 119 of histone H2A (H2AK119ub). ncPRC1.1 is crucial in development and differentiation. In sarcomas, BCOR fuses to recurrent partners, leading to remarkably overlapping transcription and DNA methylation patterns, indicative of a convergent pathological mechanism. However, this mechanism is still not understood, and we do not know how these mutations affect the role of BCOR within ncPRC1.1. I modelled two oncofusions, BCOR::CCNB3 and ZC3H7B::BCOR, in immortalized human mesenchymal stem cells by simultaneous induction of the fusions and silencing of the endogenous BCOR gene. RNA sequencing (RNA-seq) revealed drastic transcriptional remodeling which mimicked a patient-derived BCOR sarcoma transcriptional signature, and upregulation of many PRC targets. Canonically, assembly of ncPRC1.1 is initiated by binding of BCOR and PCGF1 to the targeting subunit KDM2B. Despite drastically remodelling the transcriptional landscape, I found that the BCOR oncofusions are retained at KDM2B-marked ncPRC1.1 sites genome-wide. Using co-immunoprecipitation (co-IP) and an imaging-based in vitro chromatin recruitment assay, I showed that the BCOR fusions interact with PCGF1 and KDM2B and participate in active ncPRC1.1 complexes that deposit H2AK119ub, ruling out a loss-of-function mechanism. To investigate how, then, these oncofusions were contributing to the sarcoma transcriptional signature, I analyzed their interactomes by co-IP coupled to mass spectrometry (co-IP-MS). Thus, I identified novel interactors gained by the BCOR fusions, including many transcriptional activators and cofactors. Shared between the two fusions were the histone acetyltransferases EP300/CREBBP, which were previously identified as fusion partners to BCOR in other cancers. EP300/CREBBP recruitment to the BCOR fusions was mediated by the fusion partners CCNB3 and ZC3H7B. To confirm their role in transcriptional regulation in sarcomas, I developed a sarcoma patient-derived cell line with a BCOR::CCNB3 alteration (BC3). In the BC3 cells, EP300 and H3K27ac co-occupied BCOR::CCNB3 genome loci. EP300 inhibition and CRISPR/Cas9 knock out of BCOR::CCNB3 both led to downregulation of PRC target gene sets. Despite the transcriptional effect, EP300 inhibition in the BC3 cells did not lead to a proliferative defect. This work demonstrated that BCOR::CCNB3 and ZC3H7B::BCOR recruit transcriptional activators that lead to transcriptional rewiring by a gain-of-function mechanism. EP300/CREBBP, which were identified amongst the top interactors, were found to contribute to the characteristic transcriptional profiles. Together, this work reveals key mechanistic insights into the role of fusion proteins in sarcomas. These findings lay the groundwork for future studies to elucidate how these altered transcriptional programs contribute to carcinogenesis in patients and provide mechanistic rationale for novel therapeutic targets.

Translation of abstract (German)

Sarkome sind eine heterogene Gruppe von mesenchymalen Tumoren, die in Knochen und Weichteilen entstehen und bei Kindern und jungen Erwachsenen gehäuft auftreten. Aufgrund ihrer großen molekularen Vielfalt und eines Mangels an experimentellen Modellen gab es in den letzten Jahrzehnten wenig Fortschritt in der Behandlung dieser Tumore. Häufig entstehen Sarkome aufgrund von Translokationen, bei denen transkriptionelle und epigenetische Regulatoren fusionieren, was zu charakteristischen Genexpressionsprofilen führt. Eine häufig betroffene Zielstruktur ist der BCL6-Co-Repressor (BCOR), ein Mitglied des nicht-kanonischen repressiven Polycomb-Komplexes 1.1 (ncPRC1.1), der das Gen-Silencing mittels Ubiquitinierung von Lysin 119 des Histons H2A (H2AK119ub) fördert. ncPRC1.1 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Differenzierung von Zellen. Bei Sarkomen fusioniert BCOR mit wiederkehrenden Genpartnern, was zu bemerkenswert überlappenden Transkriptions- und DNA-Methylierungsmustern führt und auf einen gemeinsamen pathologischen Mechanismus hindeutet. Wie diese genetischen Rearrangements die Funktion von BCOR innerhalb von ncPRC1.1 beeinflussen ist allerdings unklar. Um dies genauer zu untersuchen habe ich in der vorliegenden Arbeit zwei Onkofusionen, BCOR::CCNB3 und ZC3H7B::BCOR, in immortalisierten menschlichen mesenchymalen Stammzellen durch zeitgleiche Induktion der Fusionen und Silencing des endogenen BCOR-Gens modelliert. RNA-Sequenzierungs-Analysen (RNA-seq) zeigten dabei eine drastische Umgestaltung der Transkription, welche eine in Patienten identifizierte BCOR-Sarkom-Transkriptionssignatur nachahmte, sowie eine Hochregulierung von PRC1-Zielgenen. Kanonisch wird der Aufbau von ncPRC1.1 durch die Bindung von BCOR und PCGF1 an die Targeting-Untereinheit KDM2B eingeleitet. Trotz der drastischen Umgestaltung der Transkriptionslandschaft zeigte sich, dass BCOR-Onkofusionen an KDM2B-markierten ncPRC1.1-Stellen genomweit erhalten bleiben. Mithilfe von Co-Immunpräzipitation (Co-IP) und einem Chromatin-Rekrutierungstest konnte ich zeigen, dass die BCOR-Fusionen mit PCGF1 und KDM2B interagieren und an aktiven ncPRC1.1-Komplexen beteiligt sind, welche H2AK119ub ablagern. Dies schließt einen Loss-of-Function-Mechanismus aus. Um zu untersuchen ob weitere Proteininteraktionen zur BCOR-fusionstypischen Transkritpionssignatur beitragen, wurde Co-IP mit Massenspektrometrie (MS) kombiniert. Dabei konnte ich neue Interaktoren der BCOR-Fusionen identifizieren, darunter viele Transkriptionsaktivatoren und Kofaktoren. Über beiden Fusionen konserviert waren dabei die Histon-Acetyltransferasen EP300/CREBBP, die bereits bei anderen Krebsarten als Fusionspartner von BCOR identifiziert wurden. Die Rekrutierung von EP300/CREBBP zu den BCOR-Fusionen wurde durch die Fusionspartner CCNB3 und ZC3H7B vermittelt. Um ihre Rolle in der Genregulation in Sarkomen zu validieren, habe ich eine humane durch BCOR::CCNB3 getriebene Sarkomzelllinie (BC3) etabliert. Bei BC3-Zellen waren die Genom-Loci von BCOR::CCNB3 gemeinsam von EP300 und H3K27ac besetzt. Sowohl die Hemmung von EP300 als auch das Ausschalten von BCOR::CCNB3 durch CRISPR/Cas9 führten zu einer Herunterregulierung von PRC1-Zielgenen. Trotz der transkriptionellen Wirkung führte die EP300-Inhibition in den BC3-Zellen nicht zu einem Proliferationsdefekt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass BCOR::CCNB3 und ZC3H7B::BCOR Transkriptionsaktivatoren rekrutieren, welche das Tumortranskriptom maßgeblich bestimmen. EP300/CREBBP wurden dabei als wesentliche Interaktoren identifiziert. Insgesamt liefert diese Arbeit wichtige mechanistische Erkenntnisse zur Rolle von Fusionsproteinen bei Sarkomen. Die Ergebnisse bilden die Grundlage für künftige Studien zur Klärung der Frage, wie die veränderten Transkriptionsprogramme zur Krebsentstehung bei Patienten beitragen und liefern die mechanistische Grundlage zur Etablierung zielgerichteter Therapien.