German Title: Struktur der Mikrotubuli-Nukleationsstellen

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Abstract

Microtubules (MTs) are part of cytoskeleton responsible for cell cargo trafficking, cell shape and cell division. Nucleation of microtubules occurs at specific cellular organelle called microtubule organizing centrum (MTOCs). As the mayor microtubule nucleator is consider g tubulin complexes (gTuC). In lower eukaryotes it is created via tetrameric complex created by GCP2, GCP3 and two copies of g-tubulins, called g tubulin small complex (gTuSC). In higher eukaryotes the complex is more intricate, formed with additional GCPs (GCP4-6). I have precipitated in discovery of the structure of vertebrates gTuRC (g-tubulin ring complex). Surprisingly, vertebrates gTuRC is asymmetric to microtubule symmetry and deep inside of its structure is embedded actin molecule. My PhD worked focused on understanding which conformational changes occurs in γTuRC upon microtubule nucleation and what is the fate of actin. Therefore, I established protocols for purification of gTuRC capped microtubule minus ends for purposes of the cryo EM analysis and the biochemical analysis. From structure of Xenopus leavis gTuRC capped microtubule minus ends induced via RanGTP chromosomal pathway, I could observe the misalignment of MT protofilaments from spokes of gTuRC and as well as partial closure of gTuRC. These features may be recognised by MTs minus end binding proteins (-TIPs). I could demonstrate it with CAMSAP2, MT -TIPs proteins. CAMSAP2 specifically recognise the native or recombinantly prepared gTuRC capped microtubule minus ends. As well as I could demonstrate the increased MT nucleation in Xenopus leavis egg’s extract with influence of CAMSAP2 and katanin p60. With immunofluorescence analysis, I identified actin inside gTuRC. I could deny the possibility of actin filaments assembly from this position. I have purified the Drosophila melanogaster γTuRC, that resembled the conformation of vertebrates gTuRC and have densities corresponding to actin densities in vertebrates gTuRC. By omitting actin binding site, I could purify intact actin-deficient gTuRC from human cells and confirm that actin is not necessary for gTuRC assembly. By analysing the position of actin inside of gTuRC capped microtubule minus, I could observe the repositioning of actin densities, suggesting its involment into MT nucleation. Mine work brought better insight into understanding of microtubule nucleation and its regulation.

Translation of abstract (German)

Mikrotubuli (MTs) sind Teil des Zytoskeletts und verantwortlich für den Zelltransport, die Zellform und die Zellteilung. Die Mikrotubuli-Nukleation erfolgt an bestimmten Zellorganellen, den sogenannten Mikrotubulus-Organiationszentrum (MTOC). Als wichtigste Mikrotubuli-Nukleator gelten yTubulin-Komplexe (yTuCs). In niederen Eukaryoten wird es über einen tetrameren Komplex erzeugt, der aus GCP2, GCP3 und zwei Kopien von y- Tubulinen besteht und als y-Tubulin-Kleinkomplex (y-TuSC) bezeichnet wird. Bei höheren Eukaryoten ist der Komplex komplexer und besteht aus zusätzlichen GCPs (GCP4-6). Ich war maßgeblich an der Entdeckung der Struktur des yTuRC (y-Tubulin-Ringkomplexes) von Wirbeltieren beteiligt. Überraschenderweise ist yTuRC bei Wirbeltieren asymmetrisch zur Mikrotubuli-Symmetrie und tief im Inneren seiner Struktur ist ein Aktinmolekül eingebettet. Meine Doktorarbeit fokussierte sich auf das Verständnis, welche Konformationsänderungen in yTuRC bei der Mikrotubuli-Nukleation erscheinen und was das Schicksal von Aktin ist. Daher habe ich Protokolle erstellt für die Reinigung der mit yTuRC abgedeckten Mikrotubuli-Minusenden für die Zwecke der Kryo-EM-Analyse und der biochemischen Analyse. Anhand der Struktur der yTuRC bedeckten Mikrotubuli-Minusenden, die über den RanGTP-Chromosomenweg induziert werden, konnte ich die Fehlausrichtung der MT-Protofilamente von den Unterinheiten von yTuRC ebenso wie den partiellen Verschluss von yTuRC beobachten. Diese Merkmale können anhand der MTs Minusenden Endbindungsproteinen (-TIPs) erkannt werden. Ich konnte dies mit CAMSAP2, den MT-TIPs- Protein, demonstrieren. CAMSAP2 erkennt spezifisch die nativen oder rekombinant hergestellten yTuRC- bedeckten Mikrotubuli-Minusenden. Zudem konnte ich die erhöhte MT- Nukleation im Ei Extrakt des Xenopus leavis unter Einfluss von CAMSAP2 und Katanin p60 nachweisen. Mit der Immunfluoreszenzanalyse konnte ich Aktin in yTuRC feststellen. Von dieser Stelle aus konnte ich die Möglichkeit einer Polymerisation von Aktinfilamenten ablehnen. Ich habe das Drosophila melanogaster yTuRC gereinigt, welches der Konformation von Wirbeltieren yTuRC ähnelt und Dichten aufweist, welche den Aktin-Dichten von Wirbeltieren yTuRC entsprechen. Durch das Weglassen der Aktin-Bindungsstelle konnte ich intaktes Aktin- defizientes yTuRC aus menschlichen Zellen reinigen und belegen, dass Aktin für den TuRC- Zusammenbau nicht notwendig ist. Mit der Analyse der Position von Aktin im yTuRC bedeckten Mikrotubuli-Minus, konnte ich die Neupositionierung der Aktin-dichten feststellen, welches darauf hindeutet, dass es an der MT-Nukleation beteiligt ist. 6 Meine Arbeit brachte einen besseren Einblick in das Verständnis der Keimbildung von Mikrotubuli und deren Regulierung.