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Abstract

The emergence of molecular targeted therapies has marked a paradigm shift in the scope of anticancer therapy in recent decades. However, acquired resistance to treatment and severe side effects frequently limit the efficacy of current therapies. Additionally, targeting solid tumors therapeutically remains a significant challenge due to the intricate complexity of both the tumor and its surrounding microenvironment. With this concept in mind, I aimed to develop new therapeutic strategies to achieve highly specific targeting of tumor cells without damaging normal cells, ultimately improving outcomes with fewer adverse effects. To this end, I explored approaches in the fields of cancer nanomedicine, genetics, and immunotherapy.

In the first approach, I examined the anti-tumor efficacy of indocyanine nanoparticles (INPs) encapsulating proteasome inhibitors that have not yet been used for the treatment of solid tumors. Carfilzomib (CFZ) INPs exhibited improved growth inhibition of murine primary liver cells in vitro compared to CFZ diluted in DMSO, driving cells into G2/M-phase cell cycle arrest and subsequent caspase-mediated apoptosis. Moreover, CFZ INPs were well-tolerated in vivo and showed specific accumulation in murine autochthonous liver tumors. However, these INPs did not demonstrate an improved therapeutic effect against such tumors compared to the experimental controls. Other strategies, such as combined INPs encapsulating CFZ and the tyrosine kinase inhibitor sorafenib, did not provide a therapeutic advantage either. Thus, further investigations employing other in vivo models are required to ascertain the reason underlying the lack of anti-tumor activity of these newly developed INPs.

In the second approach, I investigated how passenger or bystander events in genomic amplifications could be therapeutically exploited by providing targetable molecules on the cell surface. For this, I screened the genomic status and expression levels of cell surface protein- coding genes (CSPs) in hepatocellular carcinoma (HCC) using publicly available multi-omics data. This screen identified MPZL1 gene (Myelin protein zero-like 1), located in chromosome 1q, as a CSP-coding gene amplified in 75% of HCCs, with elevated mRNA levels in tumors compared to healthy livers. I further assessed MPZL1 protein expression in different human tissues of cancerous (n=2244) and normal (n=90) origin by immunohistochemistry, assigning expression scores equivalent to the HER2-score employed in the clinics. A high percentage of tumors received scores 2 or 3, such as 48% of HCCs or 89% of TNBCs, compared to healthy tissues, which mostly got scores 0 or 1. Next, a highly specific monoclonal antibody against the extracellular domain of human MPZL1 protein was developed to target MPZL1-expressing cells, and its scFv sequence was subsequently utilized to generate a chimeric antigen receptor (CAR) construct against MPZL1. T cells expressing this CAR construct showed specific killing of several human cancer cell lines in vitro, along with enhanced cytotoxic cytokine production (TNFα, IFNγ, GZMB, IL-2) when encountering the specific antigen. Importantly, MPZL1-28ζ CAR-T cells induced regression of human MPZL1+ tumors in liver and breast cancer cell line- derived xenograft mouse models, as well as complete eradication of murine autochthonous liver tumors with human MPZL1 overexpression. In summary, my results revealed MPZL1 as a novel therapeutic target for tumors harboring amplification of chromosome 1q, a recurrent phenomenon across cancer genomes, and provided proof of concept highlighting the potential of passenger events within large chromosomal amplifications as potent therapeutic targets.

Translation of abstract (German)

Die Entwicklung zielgerichteter molekularer Therapien hat in den letzten Jahrzehnten zu einer Veränderung in der Denkweise im Bereich der Krebstherapie geführt. Jedoch begrenzen erworbene Resistenzen gegen Behandlungen, sowie schwere Nebenwirkungen häufig die Wirksamkeit der aktuellen Therapien. Zusätzlich stellt die therapeutische Bekämpfung solider Tumore aufgrund der Komplexität sowohl des Tumors als auch seiner Mikroumgebung eine bedeutende Herausforderung dar. Mithilfe dieser Erkenntnis habe ich mir das Ziel gesetzt neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die hochspezifisch und auf Tumorzellen zielgerichtet sind, ohne normale Zellen zu schädigen und damit eine Behandlung mit weniger Nebenwirkungen zu erreichen. Zu diesem Zweck habe ich in den Bereichen der Krebsnanomedizin, Genetik und Immuntherapie geforscht.

In einem ersten Projekt untersuchte ich die antitumorale Wirksamkeit von Indocyanin- Nanopartikeln (INPs), die Proteasominhibitoren einschließen, die bisher nicht zur Behandlung von soliden Tumoren eingesetzt wurden. Carfilzomib (CFZ) INPs zeigten in vitro eine verstärkte Hemmung des Wachstums von primären, murinen Leberzellen. Im Vergleich dazu gingen die Zellen in DMSO verdünntem CFZ in den G2/M-Phasen-Zellzyklusarrest über, was eine caspase-vermittelte Apoptose auslöste. Darüber hinaus wurden CFZ INPs in vivo gut vertragen und wiesen eine spezifische Anreicherung in autochthonen Lebertumoren von Mäusen auf. Diese INPs zeigten jedoch im Vergleich zu den experimentellen Kontrollen keinen therapeutischen Effekt. Andere Strategien, wie kombinierte INPs, die CFZ und den Tyrosinkinase-Inhibitor Sorafenib einschließen, boten ebenfalls keinen therapeutischen Vorteil. Um die Ursache der ausbleibenden antitumoralen Aktivität dieser neu entwickelten INPs zu ermitteln, sind weitere Untersuchungen und neue in vivo-Modelle erforderlich.

In einem zweiten Projekt untersuchte ich, wie parallel ablaufende Prozesse in der genomischen Amplifikationen therapeutisch genutzt werden könnten, indem erreichbare Moleküle auf der Zelloberfläche bereitgestellt werden. Hierfür habe ich den genomischen Status und die Expressionsniveaus von Genen, die Proteine an der Zelloberfläche kodieren (CSPs), beim hepatozellulären Karzinom (HCC) unter Verwendung öffentlich zugänglicher Multi-Omics-Daten gescreent. Diese Analyse identifizierte das MPZL1-Gen (Myelin Protein Zero-like 1) auf Chromosom 1q als ein CSP-kodierendes Gen, das in 75% der HCCs amplifiziert ist und im Vergleich zu gesunden Lebern erhöhte mRNA-Niveaus aufweist. Darüber hinaus habe ich die MPZL1-Proteinexpression in verschiedenen menschlichen Geweben krebserkrankter (n=2244) und normaler (n=90) Herkunft mittels Immunhistochemie untersucht und Expressionsscores vergeben, die dem im klinischen Bereich verwendeten HER2-Score entsprechen. Ein hoher Prozentsatz von Tumoren erhielt Scores von 2 oder 3, wie zum Beispiel 48% der HCCs oder 89% der TNBCs, im Vergleich zu gesunden Geweben, die größtenteils Scores von 0 oder 1 erhielten. Anschließend wurde ein hochspezifischer monoklonaler Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen MPZL1-Proteins entwickelt, um MPZL1-exprimierende Zellen zu ermitteln. Seine scFv-Sequenz wurde anschließend verwendet, um einen chimären Antigenrezeptor (CAR) gegen MPZL1 zu entwickeln. T-Zellen, die dieses CAR-Konstrukt exprimierten, zeigten in vitro eine spezifische Abtötung mehrerer menschlicher Krebszelllinien sowie eine verstärkte Produktion zytotoxischer Zytokine (TNFα, IFNγ, GZMB, IL-2), wenn sie dem spezifischen Antigen begegneten. Besonders hervorzuheben ist, dass MPZL1-28ζ CAR-T-Zellen in Mausmodellen mit xenogenen Leber- und Brustkrebszelllinien sowie in Mausmodellen mit autochthonen Lebertumoren mit humaner MPZL1-Überexpression das Wachstum von MPZL1+ Tumoren rückgängig machten und vollständig beseitigten. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse MPZL1 als neuartiges therapeutisches Ziel für Tumoren mit Amplifikationen des Chromosoms 1q, ein häufiges Phänomen in Krebsgenomen. Zudem liefern sie den Nachweis der Hypothese das Passagierereignisse innerhalb großer chromosomaler Amplifikationen als wirksame therapeutische Ziele dienen können.