German Title: Design von metallbindenden globulären β-Faltblatt-Miniproteinen als Biosensoren und künstliche Enzyme

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Abstract

In recent years, numerous proteins with novel structures and functions have been created through design. However, these are mostly α-helical structures whose sequence-structure relationship are largely understood. This is not the case for globular β-sheet proteins. In the present work, the well-studied WW domain of hPin1 and the β-hairpin Trpzip2 were selected as scaffolds to design mini-metalloproteins for catalytic and biosensory applications. For this purpose, a binding site of three histidines was introduced on the surface of the β-sheets, as well as additional mutations to influence the stability of the peptides and avoid additional binding sites. The designed WW domains selectively bound Ni(II), Cu(II) and Zn(II) with characteristic reversible conformational changes. Metal binding led to an increase in thermostability, with the metal complexes displaying melting temperatures of up to 70 °C. Furthermore, a positive correlation between the thermostability of the apo-peptide and the binding affinities to the metal ions was observed. The designed β-hairpin behaved similarly to the WW domains in its binding properties but displayed even higher thermostabilities of up to 80 °C, as well as stability towards chaotrophic salts and organic solvents. The mini-metalloproteins were only slightly to moderately catalytically active (hydrolysis, phenol oxidation and CuAAC), but their selective and reversible conformational change makes them very suitable for biosensing. By introducing an artificial fluorescent amino acid with a 7-mercapto-4-methylcoumarin side chain via late-stage functionalization on the solid phase, an iFRET-based metal ion sensor was developed that also detected bioactive molecules such as glyphosate or pyrophosphate through the competition of metal binding or direct interaction via the change in FRET intensity. An expansion of the analyte scope was achieved by the design of a receptor array of mini-metalloproteins, which was able to distinguish glyphosate from other bioactive molecules. Solid phase peptide synthesis was used to synthesize the miniproteins. However, the amino acid aspartate, which may be important for coordination sites and stability, can lead to undesired aspartimide formation during synthesis. To suppress this side reaction, the use of the cyanosulfurylide protecting group (CSY) was optimized for microwave-assisted synthesis. First, the CSY-protected aspartate building block was synthesized on a multi-gram scale. The coupling of the building block was carried out under heating, but the deprotection of the temporary protecting group by piperidine must be carried out at room temperature. The CSY-protected peptides were obtained in excellent quality were finally deprotected under oxidative conditions, which required the addition of hexafluoroisopropanol.

Translation of abstract (German)

Durch Design wurden in den letzten Jahren eine Vielzahl von Proteinen mit neuartigen Strukturen und Funktionen dargestellt. Allerdings handelt es sich meistens um α-helikale Strukturen, deren Sequenz-Struktur-Beziehung weitgehend verstanden sind. Für globuläre β-Faltblattproteine ist es hingegen nicht der Fall. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die gut untersuchte WW-Domäne der hPin1 und die β-Haarnadel Trpzip2 als Grundgerüst ausgewählt, um Mini-Metalloproteine für katalytische und biosensorische Anwendungen zu designen. Dazu wurde eine Bindungsstelle aus drei Histidinen auf der Oberfläche der β-Faltblattgerüste eingeführt, sowie zusätzliche Mutationen, um die Stabilität der Peptide zu beeinflussen und zusätzliche Bindungsstellen zu vermeiden. Die designten WW-Domänen binden selektiv Ni(II), Cu(II) und Zn(II) unter charakteristischen reversiblen Konformationsänderungen. Dabei führte Metallbindung zu einer Erhöhung der Thermostabilität, mit Schmelztemperaturwerten von bis zu 70 °C. Es konnte weiterhin eine positive Korrelation zwischen der Thermostabilität des Apo-Peptids und der Bindungsaffinität beobachtet werden. Die designte β-Haarnadel verhielt sich in ihren Bindungseigenschaften ähnlich wie die WW-Domänen, wies aber eine noch höhere Thermostabilität von bis zu 80 °C, sowie Stabilität gegenüber chaotropen Salzen und organischen Lösungsmitteln auf. Die Mini-Metalloproteine waren nur gering bis mäßig katalytisch aktiv (Hydrolyse, Phenoloxidation und CuAAC), jedoch sind sie aufgrund ihrer selektiven und reversiblen Konformationsänderung sehr gut für die Biosensorik geeignet. Durch die Einführung einer künstlichen fluoreszierenden Aminosäure mit einer 7-Mercapto-4-Methylcumarin-Seitenkette über eine späte Funktionalisierungsstrategie auf der festen Phase wurde ein iFRET-basierter Metallionensensor entwickelt, der auch bioaktive Moleküle wie Glyphosat oder Pyrophosphat über die Kompetition der Metallbindung oder die direkte Wechselwirkung über die Änderung der FRET-Intensität nachweisen kann. Eine Erweiterung des Analytenspektrums wurde durch das Design eines Rezeptor-Arrays aus Mini-Metalloproteinen erreicht, welches Glyphosat von anderen bioaktiven Molekülen unterscheiden konnte. Festphasenpeptidsynthese wurde verwendet, um die Miniproteine darzustellen. Jedoch führt die Aminosäure Aspartat, die für Koordinationsstellen und Stabilität wichtig sein kann, während der Synthese zur unerwünschten Aspartimidbildung. Um diese Nebenreaktion zu unterdrücken, wurde die Verwendung der Cyanosulfurylid-Schutzgruppe (CSY) auf die mikrowellengestützte Synthese optimiert. Zuerst wurde der CSY-geschützte Aspartat-Bausteins im Multigramm-Maßstab dargestellt. Die Kupplung des Bausteins erfolgte unter Erhitzen, jedoch musste die Abspaltung der temporären Fmoc-Schutzgruppe durch Piperidin bei Raumtemperatur erfolgen. Die in exzellenter Qualität erhaltenen CSY geschützten Peptide wurden final oxidativ entschützt, wobei ein Zusatz von Hexafluorisopropanol notwendig war.