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Abstract

Die Zytokinese ist ein wichtiger biologischer Prozess für die Zellproliferation. Die Mikrotubuli (MT) als Zytoskelettmitglied ist für die Zellmigration, Zellteilung und Zellpolaritätsbildung unverzichtbar. Daher ist die Untersuchung des MT-Nukleationsmechanismus unerlässlich. γ-TuRC ist sowohl für centrosomalen MTOCs (centrosomalen Microtubule Organizing Centers) als auch bei ncMTOCs (noncentrosomalen Microtubule Organizing Centers) die MT-Nukleationsvorlage in Zellen. In dieser Arbeit konzentriere ich mich hauptsächlich auf das ncMTOC-System in C. albicans (SPB (Spindelpolkörper)) und versuchen diesen biologischen Mechanismus zu verstehen. In dieser Studie ist es mir gelungen, in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Stefan Pfeffer, zwei Kryo-EM-Strukturen der MT-Kernbildungseinheit in C. albicans zu erhalten, die neue Einblicke in das Verständnis der MT-Ausbildung in C. albicans lieferten. Der 3.6 Å γ-TuSC-Komplex ist ein Monomer und bildet eine Y-förmige Struktur aus, die in Zusammenarbeit mit Dr. Erik Zupa aufgeklärt wurde. Mit der Strukturanalyse und den Mutationsexperimenten fand ich eine Insertionsschleife in Spc98, die mit Spc97 interagiert und den γ-TuSC stabilisiert. Darüber hinaus implizierten die Untersuchungen unterschiedlichen γ-Tubulin-Positionen in C. albicans und Xenopus die für die Aktivierung des γ-Tubulin-Ringkomplexes in C. albicans erforderlich sind2, 3. Die andere Kryo-EM-Struktur ist der 3.6 Å γ-TuRC auf der zytoplasmatischen Seite des SPBs, der durch die Co-expression von γ-TuSC mit Spc72 und Stu2 erhalten wurde. Dieser Teil wurde in Zusammenarbeit mit Bram Vermeulen (Doktorand aus der Gruppe von Dr. Stefan Pfeffer) durchgeführt. Mit Hilfe dieser Studie fanden wir überraschenderweise heraus, dass das Spc72CM1 als Dimer an Spc97 bindet und die dimerisierten CM1-Motive für die Oligomerisierung von γ-TuSC und die Zellviabilität entscheidend waren. Darüber hinaus fand ich auch die N-terminale Region des CM1-Motivs, die mit dem benachbarten Spc98 interagiert, was ebenfalls wichtig für die Förderung der Oligomerisierung von γ-TuSC ist. Darüber hinaus habe ich erfolgreich bestätigt, dass die C-terminale Region von Spc72(291-599) für die Interaktion mit der Cterminalen Helix von Stu2(894-924) essentiell ist. Basierend auf den monomeren und oligomeren Strukturen von γ-TuSC bestätigten wir die entscheidende Rolle dimerer CM1-Motive bei der γ-TuSC-Oligomerisierung. Darüber hinaus lieferte die direkte Bindung zwischen Spc72 und Stu2 in C. albicans auch weitere Hinweise darauf, dass Stu2 über seine gebundenen α/β-Tubulin-Dimere auf der zytoplasmatischen Seite die Mikrotubulinukleationsaktivität von an γ-TuRC stimuliert. In Zukunft muss untersucht werden, wie Stu2 auf struktureller Ebene an das γ-TuRC bindet, um die Funktion von Stu2 im MT-Ausbildungsprozess zusammen mit γ-TuRC besser zu verstehen. Der MTAusbildungsmechanismus auf der Kernseite ist ebenso wichtig zu untersuchen.