German Title: Programmierung menschlicher Makrophagen durch GDF-15

Preview

PDF, English - main document Download (6MB) | Terms of use

Abstract

GDF-15 is a multifunctional cytokine involved in immune tolerance that is elevated in stress conditions, correlating with disease severity and survival. GDF-15 is expressed by macrophages and can be endocytosed by the scavenger receptor stabilin-1. The role of GDF-15 in macrophages and its effects on the macrophage transcriptional program have been studied to only a limited extent. The aims of this study were: 1) to develop a model system to study the effect of recombinant human GDF-15 (rGDF-15) on macrophages; 2) to identify the transcriptional program induced by GDF-15 in macrophages by RNA-Seq and validate differentially expressed genes using RT-PCR; 3) to bioinformatically analyze the role of GDF-15, stabilin-1, and GDF-15-mediated pathways in most relevant cancers, particularly in kidney renal clear cell carcinoma (KIRC). Human monocytes were isolated from buffy coats by CD14+ positive selection and differentiated into M0 (non-stimulated), M1 (IFN-γ stimulated) and M2 (IL-4 stimulated) macrophages for 6 days. The selected protocol was as follows: on the day 6 of macrophage differentiation, a pretreatment with 50 ng/mL rGDF15 was performed for 1 hour, followed by a 6 hour challenge with 100 ng/mL LPS. RNA was isolated and total RNA Seq was performed in M0 and M2, revealing that rGDF15 altered the expression of 210 genes in M0 and of 372 in M2. rGDF15 and LPS in M0 and M2 exhibited changes in 230 and 295 genes, respectively. Top upregulated Gene Ontology (GO) terms, in both M0 and M2 treated with rGDF15 were associated with blood vessel morphogenesis and angiogenesis. In M0 and M2 under rGDF-15 and LPS, top upregulated GO terms belonged to TGF-β receptor and cytokine signaling pathways. Thirteen genes were selected for validation by RT-PCR. M1 phenotype was also included for validation. RT-PCR showed that rGDF-15 increased expression of CLEC12A in M0+LPS and M1+LPS, ID3 in M2 and M2+LPS, SMAD6 in M0, M2 ± LPS, and of IL17RB and PMEPA1 in all groups. rGDF-15 suppressed expression of CCL15 in M0+LPS and M2+LPS, GAS7 in M0+LPS and PTP4A3 in M0 and M2 + LPS. This pattern of gene expression suggests an anti-inflammatory effect of rGDF-15 in macrophages. Based on the TCGA database and using TIMER2.0 and the Xena platform, GDF-15 expression in cancer tissues was investigated. Contrary to the pattern seen in other cancers, GDF-15 expression was found to be lower in KIRC compared to normal tissue. Genes induced by GDF-15 (IL17RB and SMAD6) exhibited low expression levels in KIRC compared to normal tissue. Conversely, PTP4A3, downregulated by GDF-15, showed elevated levels in KIRC. High levels of IL17RB and SMAD6, along with the low levels of PTP4A3, correlated with better patient outcomes in KIRC. Stabilin-1 is the only known scavenger receptor for GDF-15. Functional endocytosis assay and confocal microscopy revealed that titanium nanoparticles, previously shown to enhance GDF-15 production by macrophages, can suppress the scavenging function of stabilin-1 encoded by the STAB1 gene. STAB1 expression was elevated in KIRC tissue and correlated with worse survival outcomes. Impairment of the stabilin-1 scavenging function may additionally increase the bioavailability of GDF-15 in KIRC, influencing patient outcomes. In summary, GDF-15 can program human macrophages into a tolerogenic phenotype, support angiogenesis and modify TGF-β signaling. Increased GDF-15 transcription, together with impaired stabilin-1-mediated clearance, can be suggested as a mechanism by which macrophages retain their ability to limit tumor growth.

Translation of abstract (German)

GDF-15 ist ein multifunktionales Zytokin, das an der Immuntoleranz beteiligt ist und unter Stressbedingungen erhöht ist, was mit der Erkrankungsschwere und dem Überleben korreliert. GDF-15 wird von Makrophagen exprimiert und kann durch den Scavenger-Rezeptor Stabilin-1 endozytiert werden. Die Rolle von GDF-15 in Makrophagen und seine Auswirkungen auf das Transkriptionsprogramm von Makrophagen sind bisher nur in begrenztem Umfang untersucht worden. Die Ziele dieser Studie waren: 1) die Entwicklung eines Modellsystems zur Untersuchung der Wirkung von rekombinantem humanem GDF-15 (rGDF-15) auf Makrophagen; 2) die Identifizierung des durch GDF-15 in Makrophagen induzierten Transkriptionsprogramms durch RNA-Seq und die Validierung differentiell exprimierter Gene durch RT-PCR; 3) die bioinformatische Analyse der Rolle von GDF-15, Stabilin-1 und GDF-15-vermittelten Signalwegen bei den meisten relevanten Krebsarten, insbesondere beim klarzelligen Nierenzellkarzinom (KIRC). Menschliche Monozyten wurden aus Buffy Coats durch CD14+ positive Selektion isoliert und 6 Tage lang in M0 (nicht stimuliert), M1 (IFN-γ stimuliert) und M2 (IL-4 stimuliert) Makrophagen differenziert. Das gewählte Protokoll sah wie folgt aus: Am Tag 6 der Makrophagendifferenzierung wurde eine Vorbehandlung mit 50 ng/mL rGDF15 für 1 Stunde durchgeführt, gefolgt von einer 6-stündigen Belastung mit 100 ng/mL LPS. Die RNA wurde isoliert und eine Total-RNA-Seq in M0 und M2 durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass rGDF15 die Expression von 210 Genen in M0 und von 372 in M2 veränderte. rGDF15 und LPS in M0 und M2 zeigten Veränderungen bei 230 bzw. 295 Genen. Die am stärksten hochregulierten Gene Ontology (GO)-Terme, sowohl in M0 als auch in M2, die mit rGDF15 behandelt wurden, standen in Zusammenhang mit der Morphogenese von Blutgefäßen und der Angiogenese. In M0 und M2 unter rGDF-15 und LPS gehörten die am stärksten hochregulierten GO-Terme zu TGF-β-Rezeptor- und Zytokin-Signalwegen. Dreizehn Gene wurden für die Validierung durch RT-PCR ausgewählt. Der M1-Phänotyp wurde ebenfalls zur Validierung herangezogen. Die RT-PCR zeigte, dass rGDF-15 die Expression von CLEC12A in M0+LPS und M1+LPS, von ID3 in M2 und M2+LPS, von SMAD6 in M0, M2 ± LPS und von IL17RB und PMEPA1 in allen Gruppen erhöhte. rGDF-15 unterdrückte die Expression von CCL15 in M0+LPS und M2+LPS, von GAS7 in M0+LPS und von PTP4A3 in M0 und M2 + LPS. Dieses Muster der Genexpression deutet auf eine entzündungshemmende Wirkung von rGDF-15 in Makrophagen hin. Auf der Grundlage der TCGA-Datenbank und unter Verwendung von TIMER2.0 und der Xena-Plattform wurde die GDF-15-Expression in Krebsgeweben untersucht. Im Gegensatz zu anderen Krebsarten wurde festgestellt, dass die GDF-15-Expression bei KIRC im Vergleich zu normalem Gewebe geringer ist. Gene, die durch GDF-15 induziert werden (IL17RB und SMAD6), wiesen in KIRC im Vergleich zu normalem Gewebe niedrige Expressionswerte auf. Im Gegensatz dazu wies PTP4A3, das durch GDF-15 herunterreguliert wird, in KIRC erhöhte Werte auf. Hohe IL17RB- und SMAD6-Werte sowie niedrige PTP4A3-Werte korrelierten mit einem besseren Behandlungsergebnis bei KIRC. Stabilin-1 ist der einzige bekannte Scavenger-Rezeptor für GDF-15. Ein funktioneller Endozytosetest und konfokale Mikroskopie zeigten, dass Titan-Nanopartikel, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie die GDF-15-Produktion durch Makrophagen steigern, die Scavenger-Funktion von Stabilin-1, das durch das STAB1-Gen kodiert wird, unterdrücken können. Die STAB1-Expression war im KIRC-Gewebe erhöht und korrelierte mit einem schlechteren Überlebensergebnis. Die Beeinträchtigung der Stabilin-1- Reinigungsfunktion kann zusätzlich die Bioverfügbarkeit von GDF-15 in KIRC erhöhen, was sich auf die Überlebenschancen der Patienten auswirkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GDF-15 menschliche Makrophagen auf einen tolerogenen Phänotyp programmieren, die Angiogenese unterstützen und die TGF-β-Signalübertragung modifizieren kann. Eine erhöhte GDF-15-Transkription kann zusammen mit einer beeinträchtigten Stabilin-1-vermittelten Clearance als Mechanismus vorgeschlagen werden, durch den Makrophagen ihre Fähigkeit zur Begrenzung des Tumorwachstums beibehalten.