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Abstract

Cells control the degradation of aberrant or damaged proteins through ubiquitin ligases. When yeast faces protein folding imbalance, the disordered protein Roq1 binds the ubiquitin ligase Ubr1 as a substrate mimic that profoundly changes Ubr1 activity and substrate specificity from N-degron substrates to misfolded proteins. How Roq1 reprograms Ubr1 is not known on a mechanistic level. In my PhD thesis I biochemically dissected the underlying principles how Roq1 controls Ubr1 using a defined in vitro system. I could demonstrate that Roq1 governs the ubiquitination of Ubr1 substrates through two cooperating motifs. The Roq1 Nterminus controls N-degron substrate ubiquitination. The Roq1 hydrophobic motif enhances the ubiquitination of endogenous Ubr1 substrates with internal degrons and of misfolded proteins. The N-terminus and hydrophobic motif allow Roq1 to bind Ubr1 heterobivalently to generate avidity for efficient Ubr1 reprograming. Furthermore, I could show that amino acid residues C-terminal of the hydrophobic motif are dispensable for Roq1 function. How does Roq1 regulate Ubr1? Instead of promoting ubiquitin-conjugating enzyme or substrate recruitment, Roq1 enhances the ubiquitin transfer by increasing the efficiency of ubiquitin chain initiation. To understand how Roq1 manipulates Ubr1 on a structural level I determined the cryogenic electron microscopy structure of a Roq1-Ubr1 complex with an overall resolution of 6.3 Ångström, which awaits further optimization. Overall, I unraveled in my PhD thesis how the small, disordered protein Roq1 comprehensively regulates the complex ubiquitin ligase Ubr1. Given the essential role of ubiquitin ligases in diseases, the Roq1 bipartite mode of action could therefore inspire the design of new therapeutic modulators for other ubiquitin ligases.

Translation of abstract (German)

Zellen kontrollieren den Abbau von überflüssigen oder beschädigten Proteinen mithilfe von Ubiquitin-Protein-Ligasen. Wenn fehlgefaltete Proteine in der Hefezelle akkumulieren, entsteht eine zelluläre Stressreaktion. Während dieser bindet das kleine, intrinsisch ungeordnete Protein Roq1 als Pseudosubstrat die Ubiquitin-Protein-Ligase Ubr1 und steuert so nachhaltig deren Aktivität und Substratspezifität. Anstelle von N-Degron-Substraten erkennt Ubr1 nun hauptsächlich fehlgefaltete Proteine und baut diese ab. Wie Roq1 auf mechanistischer Ebene Ubr1 umprogrammiert, ist nicht bekannt. In meiner Doktorarbeit habe ich die grundlegenden Prinzipien der Ubr1-Regulation durch Roq1 in einem definierten in vitro System biochemisch untersucht. Ich konnte zeigen, dass Roq1 die Ubiquitinierung von Ubr1-Substraten über zwei miteinander agierende Motive steuert. Mittels N-Terminus kontrolliert Roq1 die Ubiquitinierung von N-Degron-Substraten. Über ein hydrophobes Element verbessert Roq1 die Ubiquitinierung von fehlgefalteten Proteinen und endogenen Ubr1 Substraten mit internen Abbausequenzen. Der N-Terminus und das hydrophobe Motiv befähigen Roq1 über einen heterobivalenten Mechanismus Ubr1 zu binden, der die benötigte Avidität für eine effiziente Umprogrammierung von Ubr1 bereitstellt. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass Aminosäuren C-Terminal des hydrophoben Motivs nicht für die Funktion von Roq1 benötigt werden. Wie reguliert Roq1 Ubr1? Anstatt die Affinität zwischen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms oder Substrates und Ubr1 zu erhöhen, steigert Roq1 die Ubiquitinierungseffizienz über eine Beschleunigung der initialen Ubiquitinkettenbildung. Um zu verstehen, wie Roq1 auf Strukturebene Ubr1 beeinflusst, habe ich mittels Kryoelektronenmikroskopie die Struktur eines Roq1-Ubr1 Komplexes gelöst bei einer globalen Auflösung von 6,3 Ångström, welche weiter optimiert werden wird. Zusammengefasst konnte ich in meiner Doktorarbeit zeigen, wie das kleine, intrinsisch ungeordnete Protein Roq1 nachhaltig die komplexe Ubiquitin-Protein-Ligase Ubr1 modulieren kann. Unter dem Gesichtspunkt, dass Ubiquitin-Protein-Ligasen Schlüsselrollen bei diversen Krankheiten einnehmen, könnten die hier gewonnen Erkenntnisse als Inspiration dienen für die Entwicklung therapeutischer Regulatoren anderer Ubiquitin-Protein-Ligasen.