German Title: Entwicklung und Design synthetischer Immunzellen für biomedizinische Anwendungen

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Abstract

Cytotoxic lymphocytes are able to recognize malignant cells through surface specific receptors and eventually induce apoptosis in their targets. This is a crucial property of the mammalian immune system’s own vigilance capabilities, to ensure the integrity of the organism. However, cancer cells that are able to evade these complex immune regulatory mechanisms develop the ability to escape recognition and elimination. Therefore, adoptive cell therapeutic approaches, with the goal to restore the ability of cytotoxic lymphocytes to recognize these malignant cells again, have evolved as promising tools for cancer treatment. Nonetheless, this cell-therapy implements top-down genetic engineering that has some limitations in terms of turn-over time, cost-effectiveness, versatility, and side effects. To reduce the complexity of living cells, I designed and developed in this thesis two bio-engineering approaches for the assembly of bio-inspired synthetic cytotoxic immune cells. First, I describe the bottom-up assembly of giant unilammelar vesicle (GUV) based synthetic immune cells which are able to induce apoptosis in target cells and at the same time to discriminate, on an antigen mediated basis, between two cancerous cell lines. Based on the achievements with the synthetic immune cells, I developed a second strategy to transfer the conceptual idea of the target cell-specific cytotoxicity to natural, red blood cell derived, membrane scaffolds. For this, I combined top-down and bottom-up synthetic biology approaches to develop cytotoxic cells on the basis of ghost red blood cells (GRBCs). Towards this end, I integrated functional lipids into the outer membrane of GRBCs and functionalized them with the apoptotic ligands FasL and TRAIL. Moreover, to maintain stable long-lasting linkage between ligands and GRBCs as required for in vivo applications, I implemented a bio-orthogonal functionalization strategy based on coordinative Co3+ complexation. Further, I was able to show that GRBC-based cell surrogates are not endocytosed and eliminated by macrophages. Importantly, in vivo experiments with mice revealed that the engineered GRBCs can circulate in the bloodstream for at least 24 h. This underscores the value of the developed system for future studies with synthetic cells in a pre- clinical context. Therefore, this study paves the way for alternative cell-based immunotherapies for cancer treatment with potentially higher versality, lower cost and reduced side effects, providing an on-demand approach in personalized medicine.

Translation of abstract (German)

Zytotoxische Lymphozyten sind in der Lage bösartige Zellen durch spezifische Oberflächenrezeptoren zu erkennen und in diesen Apoptose zu induzieren. Diese Fähigkeit der eignen Überwachung ist eine wichtige Eigenschaft des Immunsystems von Säugetieren, um die Integrität des Organismus zu gewährleisten. Allerdings gelingt es einigen entarteten Zellen die Fähigkeit der Erkennung und Eliminierung zu entgehen. Aus diesem Grund haben sich adaptive zelltherapeutische Anwendungen, die darauf abzielen die Fähigkeit zytotoxischer Lymphozyten zur Erkennung entarteter Zellen wiederherzustellen, zu einem vielversprechenden Mittel in der Krebsbehandlung entwickelt. Gleichwohl bedient sich diese Zelltherapie „Top-down“ gerichteten Gentechniken, die einige Nachteile in Bezug auf die Dauer der Umsetzung, Kosteneffizienz, Vielseitigkeit und den dazugehörigen Nebenwirkungen mit sich bringen. Um die Komplexität von lebenden Zellen zu verringern habe ich in dieser Thesis zwei biotechnische Ansätze entworfen und entwickelt, um bio-inspirierte zytotoxische synthetische Immunzellen herzustellen. Zuerst, beschreibe ich die „Bottom-up“ Herstellung von synthetischen Immunzellen, die auf großen unilamellaren Vesikeln (GUVs) basieren, und in der Lage sind die Apoptose in den Zeilenzellen zu induzieren und dabei gleichzeitig zwei Krebs-Zelllinien voneinander unterscheidet. Basierend auf diesen Entwicklungen, habe ich eine zweite Strategie ausgearbeitet, um das Konzepts der spezifischen zellgerichteten Zytotoxität, auf natürliche, Blutzell-basierten Strukturen, zu übertragen. Zu diesem Zweck, habe ich die Bereiche der „Bottom-up“ und „Top-down“ synthetischen Biologie mit einander verbunden um eine Immunzelle herzustellen, die auf „Geisterblutzellen“ (GRBCs) basiert. Zu diesem Zweck, habe ich funktionelle Lipide in die äußere Membran von GRBCs integriert und diese mit den apoptotischen Liganden FasL und TRAIL funktionalisiert. Des Weiteren habe ich eine Strategie der bio-orthogonalen Funktionalisierung verwendet, die auf der koordinativen Komplexierung von Co3+ basiert, um eine langanhaltende Bindung zwischen den GRBCs und den Liganden zu gewährleisten, die es für in vivo Anwendungen benötigt. Zudem konnte ich zeigen, dass die GRBC basierten Immunzellen nicht von Makrophagen aufgenommen und eliminiert werden. Vor allem die in vivo Experimente haben gezeigt, dass die entwickelten GRBCs für mindesten 24 Stunden im Blutkreislauf zirkulieren. Dies unterstreicht den Wert des entwickelten Systems für weitere klinische Studien mit synthetischen Zellen. Diese Arbeit ebnet den Weg für eine alternative Zell-basierte Immuntherapie für die Behandlung von Krebs, mit einer potenziell höheren Vielseitigkeit, geringen Kosten und verringerten Nebenwirkungen und bietet somit einen bedarfsgesteuerten Ansatz in der personalisierten Medizin an.