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Abstract

The endoplasmic reticulum (ER) is the major site of protein folding and lipid synthesis in eukaryotic cells. All secretory proteins are translocated into the ER, folded and modified, packed into vesicles and eventually exported towards the Golgi apparatus. These essential processes are menaced by changing environmental conditions or cellular needs. When the folding capacity in the ER lumen is overwhelmed or when lipid bilayer composition and stiffness deviate from the functional steady state, cells experience ER stress. Cells have mechanisms in place to cope with ER stress and restore homeostasis, one of which is the unfolded protein response (UPR). In this pathway, a transcriptional cascade is triggered that alleviates stress by the upregulation of chaperones and lipid synthesis genes. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, ER stress also triggers the UPR-independent recruitment of ESCRT-III component Snf7p to specific ER domains termed ER clusters. The biological role of ESCRT recruitment to ER clusters and its contribution to ER stress relief are not known. In this thesis, I characterized the phenotype of Snf7 recruitment to ER clusters in yeast. I showed that the ESCRT-associated protein Bro1 is essential for the recruitment of fluorescently labelled Snf7 to ER clusters and provided evidence that this recruitment reflects a physiological process. I performed genetic screens to identify genes involved in the formation of ER clusters upon ER stress and genes involved in recruiting Snf7 to these sites. I determined that glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor remodeling proteins, the p24 adaptor complex for ER-to-Golgi transport and its interaction with COPII proteins, the COPII ER export machinery and the Dsl1 tethering complex are required for the formation of ER clusters. I dissected the spatial arrangement of COPI component Cop1p and COPII components at ER clusters in live cell imaging and determined that Cop1p frequently co-localizes with Snf7 puncta at ER clusters whereas COPII proteins surround Snf7 puncta in a flower-like assembly. Furthermore, I observed that the ER tethering proteins Nvj2p and Tcb3p co-localize with Snf7 puncta at ER clusters and that re- localization of Tcb3p to ER clusters depends on successful ESCRT recruitment. Both Nvj2p and Tcb3p were shown to be involved in non-vesicular ceramide transport as ER-Golgi tethers during ER stress. Given the co-localization of Tcb3p and Nvj2p with Snf7 and Cop1p at ER clusters, it is conceivable that ER clusters represent ER-Golgi contact sites that might facilitate non-vesicular transport of ceramide during ER stress and thereby increase ceramide transport efficiency. In conclusion, I characterized ESCRT recruitment to ER clusters upon ER stress and assigned a potential physiological role to this process. This study adds to our understanding of ER stress responses in yeast. A better understanding of how different stress responses contribute to stress relief in yeast will improve our understanding of homologous processes in mammalian systems.

Translation of abstract (German)

Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist der wichtigste Ort der Proteinfaltung und Lipidsynthese in eukaryontischen Zellen. Alle sekretorischen Proteine werden in das ER transloziert, gefaltet und modifiziert, in Vesikel verpackt und anschließend in den Golgi-Apparat exportiert. Diese essenziellen Prozesse werden durch sich ändernde Umweltbedingungen oder zelluläre Bedürfnisse beeinflusst. Wenn die Faltungskapazität im ER-Lumen überlastet ist oder wenn die Zusammensetzung und Steifheit der Lipiddoppelschicht vom funktionalen Zustand abweicht, erfahren die Zellen sogenannten ER-Stress. Die Zellen verfügen über Mechanismen, um ER-Stress zu verringern und die Homöostase wiederherzustellen. Einer dieser Mechanismen ist die ungefaltete Proteinantwort (UPR). In diesem Signalweg wird eine Transkriptionskaskade ausgelöst, die den Stress durch die Hochregulierung von Chaperonen und Lipidsynthesegenen mildert. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae löst ER-Stress auch die UPR-unabhängige Rekrutierung der ESCRT-III-Komponente Snf7 zu spezifischen ER- Domänen, den sogenannten ER-Clustern, aus. Die biologische Rolle der ESCRT-Rekrutierung zu ER- Clustern und ihr Beitrag zur Minderung von ER-Stress sind bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit habe ich den Phänotyp der Snf7-Rekrutierung zu ER-Clustern in Hefe charakterisiert. Ich habe gezeigt, dass das ESCRT-assoziierte Protein Bro1 für die Rekrutierung von fluoreszenzmarkiertem Snf7 zu ER-Clustern essenziell ist, und konnte nachweisen, dass diese Rekrutierung einen physiologischen Prozess darstellt. Ich habe genetische Screens durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die an der Bildung von ER-Clustern bei ER-Stress beteiligt sind, sowie Gene, die für die Rekrutierung von Snf7 zu diesen Stellen benötigt werden. Ich stellte fest, dass Proteine zum Umbau des Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankers, der p24-Komplex für den ER-zu-Golgi- Transport und seine Interaktion mit COPII-Proteinen, die COPII ER-Exportmaschinerie und der Dsl1- Tethering-Komplex für die Bildung von ER-Clustern erforderlich sind. Ich konnte die räumliche Anordnung der COPI-Komponente Cop1p und den COPII-Komponenten an ER-Clustern in lebenden Zellen mikroskopisch untersuchen und feststellen, dass Cop1p häufig mit Snf7-Signal an ER-Clustern kolokalisiert, während COPII Proteine das Snf7-Signal in einer blütenartigen Anordnung umgeben. Darüber hinaus habe ich beobachtet, dass die ER-Tethering-Proteine Nvj2p und Tcb3p mit Snf7-Signal an ER-Clustern kolokalisieren und dass die Re-Lokalisierung von Tcb3p zu ER-Clustern von der erfolgreichen ESCRT-Rekrutierung abhängt. Es ist bekannt, dass Nvj2p und Tcb3p als ER-Golgi-Tether am nichtvesikulären Ceramid-Transport während ER-Stress beteiligt sind. Angesichts der Kolokalisierung von Tcb3p und Nvj2p mit Snf7 und Cop1p an ER-Clustern ist es denkbar, dass ER- Cluster bei ER-Stress ER-Golgi-Kontaktstellen darstellen, die den nichtvesikulären Transport von Ceramid erleichtern und dadurch die Effizienz des Ceramid-Transports erhöhen könnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich die Rekrutierung von ESCRT zu ER-Clustern bei ER- Stress charakterisiert und diesem Prozess eine potenzielle physiologische Rolle zugewiesen habe. Diese Studie trägt zu unserem Verständnis der ER-Stressreaktionen in Hefe bei. Ein besseres Verständnis wie verschiedene Stressreaktionen zum Stressabbau in Hefe beitragen wird unser Verständnis homologer Prozesse in Säugetiersystemen verbessern.