Preview

PDF, English - main document Download (18MB) | Terms of use

Abstract

Research of highly pathogenic viruses, such as SARS-CoV-2, is often challenging due to their inherent variability and complexity, and has to be performed in a high biosafety environment. The use of bottom-up synthetic biology provides tools to investigate specific aspects of the viral life cycle in a controlled manner. To address this I designed bottom-up synthetic SARS-CoV-2 miniviruses, named MiniVs, with the aim to study the influence of lipids on the attachment process of the viral cycle. To conduct a functional screening comparing Omicron and Alpha spike glycoproteins I utilised both ACE2-functionalised and non-functionalised planar supported lipid bilayers and giant unilamellar vesicles and discovered that Omicron had a previously unreported affinity towards lipid membranes. I measured the dissociation constants of both variant spikes to a lipid membrane and demonstrated that the affinity of Omicron spike is twice as high as the one of Alpha. These findings were further validated using two cell lines, with and without ACE2 receptor expression. Moreover, modification of the plasma membrane composition proved the importance of cholesterol in the attachment step of SARS-CoV-2. Loading the cellular membrane with different amounts of cholesterol enhanced the attachment of Omicron MiniVs. The same treatment had the opposite effect on Alpha MiniVs suggesting that the effect observed on the cell membrane is not due to membrane reorganisation and receptor clustering. Measuring the interaction between Omicron spike and SLBs with increasing amounts of cholesterol indicated that there is no specific affinity between the protein and the lipid. Finally I produced spike proteoliposomes, which consisted of full-length transmembrane Alpha or Omicron spike inserted into small unilamellar vesicles. I demonstrated that the full-length spike glycoprotein can be inserted into vesicles while remaining functional and binding to the ACE2 receptor. Proteoliposomes that contained a higher content of cholesterol on their membrane showed an increased interaction with the ACE2 receptor. Altogether, the research presented here underscores the advantages of using synthetic bottom-up assembled viruses to investigate the importance of lipids on viral infectivity, specifically during viral attachment. The results obtained highlight the differences between SARS- CoV-2 variants Alpha and Omicron, and partially explain their distinct transmissibility and pathogenicity patterns. The use of MiniVs and proteoliposomes offers a novel platform for studying specific aspects of the viral life cycle that are challenging to examine with conventional biological methods.

Translation of abstract (German)

Die Erforschung pathogener Viren wie SARS-CoV-2 ist aufgrund ihrer inha ̈renten Vari- abilita ̈t und Komplexita ̈t oft eine Herausforderung und muss in einer Umgebung mit hoher biologischer Sicherheit durchgefu ̈hrt werden. Die Verwendung der Bottom-up- Synthetischen Biologie bietet Werkzeuge, um bestimmte Aspekte des viralen Lebens- zyklus auf kontrollierte Weise zu untersuchen. Um dieses Problem anzugehen, habe ich synthetische Bottom-up-SARS-CoV-2-miniViren, genannt MiniVs, entwickelt, mit dem Ziel, den Einfluss von Lipiden wa ̈hrend der Adsorption im viralen Zyklus zu untersuchen. Um eine funktionelle Untersuchung durchzufu ̈hren, bei dem Omicron- und Alpha-Spike-Glykoproteine verglichen wurden, verwendete ich sowohl ACE2- funktionalisierte als auch nicht funktionalisierte planare Lipidschichten und große unil- amellare Vesikel und entdeckte, dass Omicron eine bisher nicht berichtete Affinita ̈t zu Lipidmembranen aufweist. Ich maß die Dissoziationskonstanten beider spike Proteine zu einer Lipidmembran und zeigte, dass die Affinita ̈t des Omicron-Spike doppelt so hoch ist wie die des Alpha-Spike. Diese Ergebnisse wurden durch die Verwendung von zwei Zelllinien mit und ohne ACE2-Rezeptorexpression weiter validiert. Daru ̈ber hin- aus bewies die Modifizierung der Plasmamembranzusammensetzung die Bedeutung von Cholesterin in der Adsorption des SARS-CoV-2 Virus. Das Beladen der Zellmembran mit unterschiedlichen Mengen an Cholesterin versta ̈rkte die Anheftung von Omicron MiniVs. Die gleiche Behandlung hatte bei Alpha MiniVs den gegenteiligen Effekt, was darauf hindeutet, dass der beobachtete Effekt auf die Zellmembran nicht auf eine Membran-Umstrukturierung und Rezeptor-clustering zuru ̈ckzufu ̈hren ist. Die Mes- sung der Interaktion zwischen Omicron-Spike und Lipidschichten mit zunehmenden Cholesterinmengen zeigte, dass es keine spezifische Affinita ̈t zwischen dem Protein und dem Lipid gibt. Schließlich stellte ich Spike-Proteoliposomen her, die aus einem Alpha- oder Omicron-Spike in voller La ̈nge bestanden, welches in kleine unilamellare Vesikel eingebracht wurde. Ich konnte nachweisen, dass das Spike-Glykoprotein in voller La ̈nge in Vesikel eingefu ̈gt werden kann, wa ̈hrend es funktionsfa ̈hig bleibt und an den ACE2- Rezeptor bindet. Proteoliposomen, die einen ho ̈heren Cholesteringehalt auf ihrer Mem- bran aufwiesen, zeigten eine versta ̈rkte Interaktion mit dem ACE2-Rezeptor. Insgesamt unterstreicht die hier vorgestellte Forschung die Vorteile der Verwendung synthetisch aufgebauter Viren zur Untersuchung der Bedeutung von Lipiden fu ̈r die virale Infek- tiosita ̈t, insbesondere wa ̈hrend der viralen Adsorption. Die erzielten Ergebnisse heben die Unterschiede zwischen den SARS-CoV-2-Varianten Alpha und Omicron hervor und erkla ̈ren teilweise ihre unterschiedlichen U ̈bertragbarkeits- und Pathogenita ̈tsmuster. Die Verwendung von MiniVs und Proteoliposomen bietet eine neuartige Plattform zur Untersuchung spezifischer Aspekte des viralen Lebenszyklus, die mit herko ̈mmlichen biologischen Methoden nur schwer zu untersuchen sind.