German Title: Epigenetische Regulation des Endothelzell-Transkriptoms während der Angiogenese und Quieszenz

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Abstract

Epigenetic mechanisms play a crucial role in determining endothelial cell (EC) states during development and disease. Investigating the epigenetic regulation of ECs during development and EC-associated diseases is essential for understanding downstream transcriptomic changes and phenotypes. In recent years, studies have incorporated DNA methylation and/or chromatin analysis to gain insights into how epigenetic modifications regulate endothelial gene expression. However, the genome-wide integration of epigenetic layers, such as chromatin accessibility, DNA methylation, and histone tail modifications, and their impact on gene expression during the EC state transition remain largely unexplored. Additionally, no hierarchical order of epigenetic layers has been identified. This thesis therefore aimed to I) uncover the epigenetic landscape of ECs in vivo during physiological state transition, II) elucidate the epigenetic reprogramming that occurs during pathological EC transition, and III) functionally characterize the role of the DNA methyltransferase DNMT3A during embryonic and postnatal vasculature development. During developmental transitions, ECs in the murine lung vasculature undergo significant transcriptomic changes to adapt to environmental cues. This state transition is driven by epigenetic modifications, particularly at enhancer regions, which are selectively accessible near state-specific genes. Developmental enhancer regions that lost their active histone modification during state transition sustained accessible chromatin and their non-methylated DNA, potentially serving as epigenetic memory. Under pathological conditions such as lung tumor development and metastasis progression, vascular reactivation requires the reestablishment of angiogenic enhancers, enabling the hijacking of developmental transcriptional programs, such as cell proliferation and migration. This process may be facilitated by chromatin-modifying enzymes, along with the preservation of DNA hypomethylation and chromatin accessibility at these enhancers. In the murine endothelium, DNA methylation is specifically mediated by DNMT3A and plays a fundamental role in shaping the endothelial enhancer landscape. Longitudinal postnatal EC analysis revealed that significant alterations in DNA methylation occurred as ECs transitioned from an angiogenic state to a quiescent state. Once vascular quiescence is established, these methylation marks remain mostly stable throughout aging. Interestingly, the edges of regulatory elements in angiogenic ECs showed reduced DNA methylation compared with those in quiescent ECs, indicating the need for active DNA methylation upon state transition. The absence of DNMT3A-dependent DNA methylation, analyzed in ECs isolated from Dnmt3a knockout mice, resulted in the loss of active enhancers, leading to subtle transcriptional changes, likely due to alterations in enhancer integrity. In the context of the murine placental vasculature, single-cell transcriptome analysis revealed that the spatial zonation of the murine placental labyrinth vasculature is controlled by flow-regulated epigenetic mechanisms. The identified blood flow-dependent zonation is crucial for proper fetal nourishment, and disruptions in this process can lead to placental insufficiency. Since DNMT3A introduces DNA methylation in ECs, its loss results in global DNA hypomethylation, impaired angiogenic capacity, and fetal growth retardation. Furthermore, a meta-analysis identified a link between reduced DNMT3A expression in the human placental endothelium and preeclampsia, highlighting its clinical relevance in placental dysfunction. Collectively, these findings underline the importance of DNMT3A as a critical regulator of endothelial cell gene expression and function across different vascular beds, with significant implications for developmental biology and disease.

Translation of abstract (German)

Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung von Endothelzellzuständen während der Entwicklung und Krankheit. Die Untersuchung der epigenetischen Regulierung von Endothelzellen (EZ) während der Entwicklung und bei EZ-assoziierten Erkrankungen ist unerlässlich, um transkriptomische Veränderungen und Phänotypen zu verstehen. In den letzten Jahren wurden in Studien DNA-Methylierung und/oder Chromatinanalysen integriert, um Einblicke in die Regulation der endothelialen Genexpression durch epigenetische Modifikationen zu gewinnen. Die genomweite Integration von epigenetischen Ebenen wie Chromatinzugänglichkeit, DNA-Methylierung und Histonmodifikationen sowie deren Einfluss auf die Genexpression während des EZ-Zustandsübergangs bleibt jedoch weitgehend unerforscht. Darüber hinaus wurde bisher keine hierarchische Ordnung der epigenetischen Ebenen identifiziert. Diese Dissertation hatte daher die Ziele, I) die epigenetische Landschaft von EZ in vivo während des physiologischen Zustandsübergangs aufzudecken, II) die epigenetische Umprogrammierung zu beleuchten, die während des pathologischen EZ-Zustandsübergangs stattfindet, und III) die funktionelle Rolle der DNA-Methyltransferase DNMT3A während der embryonalen und postnatalen Gefäßentwicklung zu charakterisieren. Während der Entwicklungsübergänge unterliegen EZ in der murinen Lungenvaskulatur signifikanten transkriptomischen Veränderungen, um sich an Umweltreize anzupassen. Dieser Zustandsübergang wird durch epigenetische Modifikationen, insbesondere in Enhancer-Regionen, gesteuert, die selektiv in der Nähe von zustandsspezifischen Genen zugänglich sind. Entwicklungsspezifische Enhancer-Regionen, die während des Zustandsübergangs ihre aktiven Histonmodifikation verlieren, behalten das zugängliche Chromatin und ihre nicht-methylierte DNA bei, was möglicherweise als epigenetisches Gedächtnis dient. Unter pathologischen Bedingungen wie der Lungenkrebsentwicklung und dem Fortschreiten von Metastasen erfordert die Gefäßreaktivierung die Wiederherstellung angiogener Enhancer, was die Expression von entwicklungsspezifischen Transkriptionsprogrammen wie Zellproliferation und -migration ermöglicht. Dieser Prozess wird möglicherweise durch chromatinmodifizierende Enzyme sowie die Erhaltung der DNA-Hypomethylierung und Chromatinzugänglichkeit an diesen Enhancern erreicht. In murinen Endothelzellen wird die DNA-Methylierung spezifisch durch DNMT3A vermittelt und spielt eine grundlegende Rolle bei der Gestaltung der endothelialen Enhancer-Landschaft. Signifikante Veränderungen der DNA-Methylierung treten bei EZ während des Überganges von einem angiogenen zu einem quieszenten Zustand auf. Sobald der quieszente Zustand etabliert ist, blieben diese Methylierungsmarkierungen größtenteils während des Alterns stabil. Interessanterweise zeigen die Ränder regulatorischer Elemente in angiogenen EZ eine reduzierte DNA-Methylierung im Vergleich zu den quieszenten EZ, was auf die Notwendigkeit einer aktiven DNA-Methylierung während des Zustandsübergangs hinweist. Das Fehlen einer DNMT3A-abhängigen DNA-Methylierung, das in EZ, isoliert von Dnmt3a-Knockout-Mäusen, analysiert wurde, führe zum Verlust aktiver Enhancer und damit zu subtilen transkriptomischen Veränderungen, wahrscheinlich aufgrund von Veränderungen in der Enhancer-Integrität. Im Kontext der murinen Plazentavaskulatur zeigte eine Einzelzell-Transkriptomanalyse, dass die räumliche Zonierung der murinen Labyrinthvaskulatur durch durchflussregulierte epigenetische Mechanismen kontrolliert wird. Die identifizierte blutflussabhängige Zonierung ist entscheidend für die ausreichende fetale Versorgung, und Störungen in diesem Prozess können zu einer Plazentainsuffizienz führen. Da DNMT3A DNA-Methylierung in EZ etabliert, führe der Verlust zu einer globalen DNA-Hypomethylierung, beeinträchtigter angiogener Kapazität der EZ und fetaler Wachstumsverzögerung. Darüber hinaus identifizierte eine Meta-Analyse einen Zusammenhang zwischen reduzierter DNMT3A-Expression im menschlichen Plazentaendothel und Präeklampsie, was die klinische Relevanz des Enzyms bei der Plazentafunktionsstörung hervorhebt. Insgesamt betonen diese Erkenntnisse die Bedeutung von DNMT3A als kritischen Regulator der Genexpression und Funktion von Endothelzellen in verschiedenen Gefäßsystemen mit Implikationen für die Entwicklungsbiologie und Krankheitsbildern.