German Title: CRISPR-Interferenz für die Hochdurchsatz-Analyse von Genfunktion in Plasmodium knowlesi

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Abstract

Malaria is still a devastating disease that is caused by infection with unicellular parasites of the genus Plasmodium. In 2022, it was responsible for an estimated 249 million cases as well as an estimated 608 000 deaths worldwide. While the disease, especially cases of uncomplicated malaria, can be treated with therapeutic intervention, emergence of resistance against these antimalarial drugs has been a continuous challenge. Elucidating gene function in a systematic way has been integral for understanding the biology in other organisms in the genomic and post-genomic era. This approach has been impeded in Plasmodium, however, due to an extraordinarily high genomic AT-content and poor transfection efficiency in Plasmodium falciparum, the strain responsible for most global cases and fatalities. The latter has put large-scale genetic approaches out of reach until relatively recently, so that currently ca. 40% of the parasite’s genes only have putative functional annotation, while ca. 30% have no functional annotation at all. Genetic studies that have been performed in Plasmodium parasites so far greatly increased our knowledge about the parasite’s genome. However, due to the nature of gene knockout approaches, they could not provide functional information about genes that are essential during the asexual blood-stage of the parasite, which has been determined to be ca. half of the genome. In contrast, knockdown approaches have the capacity to provide a quantifiable phenotype for essential genes because gene function is not entirely abrogated.

Therefore, I sought to establish gene knockdown by CRISPR interference in the parasite strain Plasmodium knowlesi in this doctoral thesis so that this technology may eventually be used for high-throughput gene function analysis. This strain was chosen because it had exhibited exceptionally high transfection efficiency in previous reports and, thus, harbored the potential to target a large part, if not all, of the parasite genome. To this end, I used a parasite line with stable expression of the catalytically inactive version of Cas9, dCas9, that had previously been generated by Ann-Kathrin Mehnert during her Master thesis. I performed initial experiments to assess this cell line’s transfection efficiency with a reporter construct, which remained inconclusive because only ca. half of transfected parasites that were resistant to the selection drug WR99210 expressed the reporter. Therefore, resistance against WR99210 was subsequently used as readout for successful transfection, revealing that parasite survival was very low and likely negatively impacted overall transfection efficiency, which I determined to be ca. 0.3%. For knockdown validation, I cloned and then transfected constructs for expression of sgRNAs targeting the essential VPS32 gene and the non-essential CEN4 and SAS6 genes into the dCas9-expressing parasite line and performed growth assays as well as transcript level analysis via RT-qPCR. Although I could not detect a significant downregulation of VPS32 transcript levels in the respective knockdown parasite line, I identified a significant growth defect of this line compared to the control line. As expected, targeting the non-essential CEN4 gene did not elicit a growth defect, however, I detected a significant downregulation in transcripts in one of the knockdown lines compared to a control line. Targeting the SAS6 gene did not result in transcriptional downregulation in any of the generated knockdown lines. In a small-scale proof-of-principle screen, I used a library comprising 20 different sgRNA constructs targeting four genes in total: VPS32, CEN4, SAS6 and CEN3. Monitoring the constructs’ relative abundance ratios over time in six conditions over two biological replicates revealed that I could not detect a specific and efficient knockdown effect in this screen with the CRISPR interference system that I employed.

In conclusion, I was able to determine the transfection efficiency of the P. knowlesi dCas9 line used in this thesis, which was lower than published efficiencies for the P. knowlesi wildtype strain but sufficiently high to, in theory, facilitate screens of moderately large scale. Additionally, I was able to show a significant downregulation of CEN4 transcripts in one knockdown parasite line as well as a significant growth defect in the VPS32 knockdown line. Unfortunately, the results of two replicates of a small-scale proof-of-principle screen revealed that I was not able to detect specific and efficient knockdown via the CRISPR interference system used in this thesis. Further inquiry into how efficient CRISPR interference works in this parasite strain and potentially subsequent development of technology is thus necessary to validate it as a tool for high-throughput genetic screening approaches.

Translation of abstract (German)

Noch immer ist Malaria eine verheerende Krankheit, die durch die Infektion von einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium ausgelöst wird. Allein im Jahr 2022 war sie verantwortlich für geschätzt 249 Millionen Krankheits- und 608 000 Todesfälle weltweit. Obwohl die Krankheit, insbesondere in unkomplizierten Fällen, medikamentös behandelt werden kann, stellt das Auftreten von Resistenzen gegenüber dieser Malariamittel eine kontinuierliche Herausforderung dar. Um die Biologie anderer Organismen zu verstehen, war das systematische Entschlüsseln von Genfunktion wesentlich in den Zeitaltern der Genomik und Postgenomik. Dieser Ansatz wurde jedoch durch einen außergewöhnlich hohen AT-Gehalt des Genoms und eine sehr geringe Transfektionseffizienz des Parasitenstamms Plasmodium falciparum, der für die weltweit meisten Krankheits- und Todesfälle verantwortlich ist, stark eingeschränkt. Die geringe Transfektionseffizienz hat bis vor kurzer Zeit genetische Ansätze in größerem Ausmaß außer Reichweite gehalten, sodass aktuell ca. 40% der Gene des Parasiten lediglich eine mutmaßliche funktionelle Annotation haben und ca. 30% keinerlei funktionelle Annotation erhalten haben. Genetische Studien, die bisher mit dem Plasmodium-Parasiten durchgeführt wurden, konnten unser Wissen über dessen Genom deutlich erweitern. Aufgrund der Natur von Gen-Knockout-Ansätzen konnten sie jedoch keine funktionellen Informationen über Gene liefern, die während des asexuellen Blutstadiums des Parasiten essenziell sind, welche etwa die Hälfte des Parasiten-Genoms ausmachen. Im Gegensatz dazu können Knockdown-Ansätze einen quantifizierbaren Phänotyp für essenzielle Gene liefern, da die Genfunktion nicht vollständig aufgehoben wird.

Aus diesem Grund habe ich in dieser Doktorarbeit den Versuch unternommen, Gen-Knockdown durch CRISPR-Interferenz im Parasitenstamm Plasmodium knowlesi zu etablieren, damit diese Technologie schließlich für die Hochdurchsatz-Gen-Funktionsanalyse verwendet werden kann. Dieser Stamm wurde ausgewählt, weil er in früheren Publikationen eine außergewöhnlich hohe Transfektionseffizienz gezeigt hatte. Daher bot er das Potenzial, einen Großteil des Genoms oder möglicherweise das gesamte Genom abdecken zu können. Zu diesem Zweck habe ich eine Parasitenlinie mit stabiler Expression der katalytisch inaktiven Version von Cas9, dCas9, verwendet, die zuvor von Ann-Kathrin Mehnert im Rahmen ihrer Masterarbeit generiert wurde. Ich führte erste Experimente durch, um die Transfektionseffizienz dieser Zelllinie mit einem Reporterkonstrukt zu erfassen. Diese ließen jedoch keine eindeutigen Aussagen zu, da nur etwa die Hälfte der transfizierten Parasiten den Reporter exprimierten, obwohl sie resistent gegen die Selektionsdroge WR99210 waren. Aufgrund dessen habe ich anschließend die Resistenz gegen WR99210 als Indikator für eine erfolgreiche Transfektion benutzt. Dabei zeigte sich, dass die Überlebensrate der Parasiten äußerst gering war und sich wahrscheinlich negativ auf die gesamte Transfektionseffizienz auswirkte, die meinen Berechnungen zufolge 0.3% betrug. Zur Knockdown-Validierung transfizierte ich Konstrukte zur Expression von sgRNAs, die auf das essenzielle VPS32-Gen und die nicht-essenziellen CEN4- und SAS6-Gene abzielten, in die dCas9-exprimierende Parasitenlinie und führte Wachstumsanalysen sowie eine Analyse der Transkriptlevel mittels RT-qPCR durch. Obwohl ich in der VPS32-Knockdown Parasiten-Zelllinie keine signifikante Herabregulierung des VPS32-Transkriptlevel feststellen konnte, stellte ich im Vergleich zur Kontrolllinie einen signifikanten Wachstumsdefekt dieser Linie fest. Wie erwartet löste das Targeting des nicht-essenziellen CEN4-Gens keinen Wachstumsdefekt aus. Dafür konnte ich im Vergleich zu einer Kontroll-Linie eine signifikante Herabregulierung der Transkripte in einer der CEN4-Knockdown-Linien feststellen. Das Targeting des SAS6-Gens führte in keiner der erzeugten Knockdown-Linien zu einer Herabregulierung der Transkription. In einem kleinen Screen habe ich eine 20 verschiedene sgRNA-Konstrukte umfassende Plasmid-Bibliothek transfiziert, die auf insgesamt vier Gene abzielten: VPS32, CEN4, SAS6 und CEN3. Das Analysieren der relativen Mengenverhältnisse dieser Konstrukte in sechs Bedingungen über zwei biologische Replikate und der verschiedenen Zeitpunkte hinweg ergab, dass ich in diesem Screen mit dem von mir verwendeten CRISPR-Interferenzsystem keinen spezifischen und effizienten Knockdown-Effekt feststellen konnte.

Zusammenfassend konnte ich die Transfektionseffizienz der in dieser Arbeit verwendeten P. knowlesi-dCas9-Linie bestimmen, die niedriger war als die veröffentlichten Effizienzen für den P. knowlesi-Wildtyp-Stamm, jedoch ausreichend hoch, um Screens in mittelgroßem Maßstab zu ermöglichen. Darüber hinaus konnte ich eine signifikante Herabregulierung der CEN4-Transkripte in einer Knockdown-Parasitenlinie sowie einen signifikanten Wachstumsdefekt in der VPS32-Knockdown-Linie nachweisen. Leider zeigten die Ergebnisse von zwei Replikaten des Proof-of-Principle-Screens, dass ich mit dem in dieser Arbeit verwendeten CRISPR-Interferenzsystem kein spezifisches und effizientes Knockdown feststellen konnte. Daher ist es notwendig weiterhin zu untersuchen, wie effiziente CRISPR-Interferenz in diesem Parasitenstamm funktioniert und gegebenenfalls fehlende Technologien zu entwickeln, damit man es als Tool für genetische Screens im Hochdurchsatz-Verfahren validieren kann.