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Abstract

The dynamic remodeling of the endoplasmic reticulum (ER) is key to maintaining cellular homeostasis upon changing physiological conditions. For instance, cells can increase ER size in response to the accumulation of misfolded proteins in the ER, a condition known as ER stress. Previous studies in Saccharomyces cerevisiae have provided evidence that ER expansion serves to improve cellular fitness upon ER stress. In mammalian cells, the range of ER stress-induced ER phenotypes and the mechanisms promoting such changes are unclear. Proteins involved in lipid metabolism have the potential to regulate ER size by controlling ER membrane biogenesis. Lipins, a conserved family of proteins acting as phosphatidic acid phosphatases and transcriptional co- regulators, have been shown to play an important role in regulating ER membrane biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. However, their possible functions in ER membrane biogenesis in mammalian cells have not been directly explored. In this study, I investigated ER membrane remodeling in human U2OS and SUM159 cells by confocal fluorescence microscopy and showed that three commonly used chemical ER stressors (Tunicamycin, Thapsigargin and Cyclopiazonic acid) can increase apparent ER size while inducing different ER morphology phenotypes, ranging from the formation of a denser peripheral tubular network to peripheral ER sheets. Moreover, I contributed to the development of a semi- automated image analysis tool to quantify ER size and morphology in an unbiased manner in large cell populations. In the second part of this study, I investigated the roles of Lipin1, Lipin2 and Lipin3 in ER size and shape control in U2OS cells, using the above-mentioned image analysis tool. I showed that simultaneous knockdown of Lipin1, Lipin2 and Lipin3, or treatment with a candidate Lipin inhibitor, induce ER membrane expansion and an increase in peripheral ER sheets. My findings also suggest that while Lipin1 and Lipin2 may have reciprocal compensatory functions, Lipin3 may play distinct roles in regulating ER size. Furthermore, I showed that Lipin1 and Lipin2 levels increase upon ER stress. This revealed that both Lipin upregulation and downregulation can correlate with ER membrane expansion. However, I showed that the ER expansion phenotype induced by Tunicamycin and the one caused by Lipin perturbation likely arise from distinct molecular mechanisms. This raises the possibility that, depending on the physiological context, cells may regulate the individual Lipins and their activities differently to achieve ER expansion. Furthermore, in this study I showed that triple knockdown of Lipin1+2+3 also impairs the formation of lipid droplets. All in all, my study identifies ER stress conditions inducing robust ER membrane remodeling in human cells and lays the foundation for investigating the mechanisms driving ER membrane remodeling and their physiological significance. Moreover, my study provides a system to investigate the contributions of the individual Lipins and their different activities in ER size and shape control as well as in lipid droplet biogenesis, at steady state and upon ER stress.

Translation of abstract (German)

Die dynamische Umgestaltung des endoplasmatischen Retikulums (ER) ist essentiell zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase bei sich ändernden physiologischen Bedingungen. So können Zellen beispielsweise die Größe des ER als Reaktion auf die Anhäufung fehlgefalteter Proteine im ER erhöhen, ein Zustand, der als ER-Stress bezeichnet wird. Frühere Studien in Saccharomyces cerevisiae weisen darauf hin, dass die ER-Expansion dazu dient, die zelluläre Fitness bei ER-Stress zu verbessern. Bei Säugetierzellen sind die Ausmaße der durch ER-Stress induzierten ER-Phänotypen und die Mechanismen, die solche Veränderungen hervorrufen, unklar. Proteine, die am Lipidstoffwechsel beteiligt sind, haben das Potenzial, die Größe des ER durch Steuerung der ER-Membranbiogenese zu regulieren. Lipine, eine konservierte Familie von Proteinen, die als Phosphatidat-Phosphatasen und transkriptionelle Co-Regulatoren fungieren, spielen nachweislich eine wichtige Rolle bei der Regulierung der ER-Membranbiogenese inSaccharomyces cerevisiae. Jedoch wurden ihre möglichen Funktionen bei der ER- Membranbiogenese in Säugetierzellen noch nicht direkt erforscht. In dieser Studie untersuchte ich die ER-Membranumgestaltung in menschlichen U2OS- und SUM159-Zellen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und zeigte, dass drei häufig verwendete chemische ER-Stressoren (Tunicamycin, Thapsigargin und Cyclopiazonsäure) die scheinbare ER-Größe erhöhen können. Dabei induzieren sie jedoch verschiedene ER- Morphologie-Phänotypen, die von der Bildung eines dichteren peripheren röhrenförmigen Netzwerks bis hin zu peripheren zisternalen Strukturen reichen. Darüber hinaus habe ich zur Entwicklung eines halbautomatischen Bildanalyse-Tools beigetragen, mit dem die Größe und Morphologie des ER auf unvoreingenommene Weise in großen Zellpopulationen quantifiziert werden kann. Im zweiten Teil dieser Studie habe ich die Rolle von Lipin1, Lipin2 und Lipin3 für die Kontrolle der Größe und Form des ER in U2OS-Zellen untersucht, indem ich das oben erwähnte Bildanalyse- Tool verwendet habe. Ich konnte zeigen, dass die gleichzeitige Herunterregulierung von Lipin1, Lipin2 und Lipin3 oder die Behandlung mit einem potenziellen Lipin-Inhibitor zu einer Ausdehnung der ER-Membran und einer Zunahme peripheren ER-Zisternen führt. Meine Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass Lipin1 und Lipin2 zwar reziproke Kompensationsfunktionen haben können, Lipin3 jedoch eine unterschiedliche Rolle bei der Regulierung der ER-Größe spielen kann. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Lipin1- und Lipin2-Spiegel bei ER-Stress ansteigen. Dies deutet darauf hin, dass sowohl die Hochregulierung als auch die Herunterregulierung von Lipin mit der Ausdehnung der ER-Membran korrelieren können. Ich konnte jedoch zeigen, dass der durch Tunicamycin induzierte ER- Expansionsphänotyp und der durch eine Lipin-Störung verursachte Phänotyp wahrscheinlich auf unterschiedlichen molekularen Mechanismen beruhen. Es besteht die Möglichkeit, dass Zellen je nach physiologischem Kontext die einzelnen Lipine und ihre Aktivitäten unterschiedlich regulieren können, um eine ER-Expansion zu erreichen. Darüber hinaus konnte ich in dieser Studie zeigen, dass ein dreifacher Knock-down von Lipin1+2+3 auch die Bildung von Lipidtröpfchen beeinträchtigt. Alles in allem identifiziert meine Studie ER-Stressbedingungen, die eine robuste Umgestaltung der ER-Membran in menschlichen Zellen induzieren, und legt den Grundstein für die Untersuchung der Mechanismen, die diese ER-Membranumgestaltung antreiben, und ihrer physiologischen Bedeutung. Darüber hinaus bietet meine Studie ein System zur Untersuchung der Beiträge der einzelnen Lipine und ihrer unterschiedlichen Aktivitäten bei der Kontrolle der ER-Größe und Form sowie der Biogenese von Lipidtröpfchen, und dies sowohl in unbeeinträchtigten als auch in ER-gestressten Zellen.