German Title: Erstellung und Erforschung von Enhancer-Gen-Regulationsnetzwerken zur Steuerung der Spermatogenese in Drosophila

PDF, English - main document Restricted access: Repository staff only until 31 December 2025. Login+Download (46MB) | Terms of use

Abstract

Cellular behaviors involved in stem cell regulation, growth, differentiation, and development are crucial progresses in the development and maintenance of lineages. Cells coordinate such behavior through communications by various mechanisms, including direct cell-cell interactions and diffusible signaling molecules, to synchronize their actions and maintain the health and complexity of the entire organism. This perceived signaling subsequently directs molecular programs consisting of specific sets of genes, which are activated by genomic cis regulatory elements (CREs) in response to various signals, and encode proteins that guide and execute critical processes such as cell differentiation, growth, and adaptation to environmental changes. Therefore, understanding how these programs are encoded and regulated provides insight into the fundamental mechanisms of cellular behavior. The Drosophila testis provides an excellent model for this; two stem cells at the niche compete for self-renewal signals, germline stem cell and somatic cyst stem cell, while maintaining a fine balance. The germline will differentiate and progress through dramatic transcriptional and genomic changes, all necessary for the formation of compacted and motile sperm. In the process, the somatic cyst lineage supports spermatogenesis, a tightly controlled process that is coordinated by extensive signaling between the two lineages. Therefore, to understand the regulatory logic behind cellular decision making, I simultaneously profiled the transcriptomes and chromatin accessibility profiles within 10,335 individual nuclei. In doing so, I identify over 90% of the Drosophila protein-coding genome being transcribed in the testis, with dynamics equal to published testis transcriptomes. Furthermore, I identified 46,619 accessible regions across all cell stages, with 14,577 of those regions showing differential accessibility. Leveraging both modalities, I constructed the first testis-specific enhancer-driven gene regulatory network (eGRN), revealing 103 activating and 44 repressing TF eRegulons in the testis, with cell specificity. Validation of the testis eGRN by means of in vivo eRegulon TF perturbations are consistent with their putative functions, or can be rationalized within the scope of spermatogenesis. Furthermore, cooperative regulation between eRegulons is characterized by the joint binding to common regulatory regions to induce the expression of sets of differential targets throughout spermatogenesis. Moreover, lineage specific CRISPR-mediated mutagenesis of either cooperating ovo or klu TFs resulted in the downregulation of their common target stg, a mitotic inducer. This reveals that eGRN prediction can facilitate the elucidation of novel roles for uncharacterized TFs in the testis. Lastly, by expanding on cell-cell communication, the previously not well characterized Wnt pathway was predicted to be active in the testis, as well as its downstream effector pan/TCF. In vivo characterization indicates that Wnt components are involved in the modulation of stem cell numbers, in particular the GSCs.

Translation of abstract (German)

Zellverhalten, die an der Regulation, dem Wachstum, der Differenzierung und Entwicklung von Stammzellen beteiligt sind, sind entscheidende Prozesse in den Entwicklungs- und Erhaltungslinien. Zellen koordinieren solches Verhalten durch Kommunikation über verschiedene Mechanismen, einschließlich direkter Zell-Zell-Interaktionen und diffundierbarer Signalmoleküle, um ihre Aktionen zu synchronisieren und die Gesundheit und Komplexität des gesamten Organismus aufrechtzuerhalten. Diese wahrgenommenen Signale lenken anschließend molekulare Programme, die aus spezifischen Gensets bestehen und durch genomische cis-regulatorische Elemente (CREs) in Reaktion auf verschiedene Signale aktiviert werden. Diese kodieren Proteine, die kritische Prozesse wie Zelldifferenzierung, Wachstum und Anpassung an Umweltveränderungen steuern und ausführen. Daher bietet das Verständnis, wie diese Programme kodiert und reguliert werden, Einblicke in die grundlegenden Mechanismen des Zellverhaltens. Der Drosophila testis bietet hierfür ein hervorragendes Modell: Zwei Stammzellen in der Nische konkurrieren um Selbsterneuerungssignale, die Keimbahn-Stammzelle und die somatische Zystenstammzelle, während ein feines Gleichgewicht aufrechterhalten wird. Die Keimbahn wird sich differenzieren und durch dramatische transkriptionelle und genomische Veränderungen fortschreiten, die alle notwendig sind, um kompaktes und bewegliches Sperma zu bilden. Während dieses Prozesses unterstützt die somatische Zystenlinie die Spermatogenese, einen streng kontrollierten Prozess, der durch umfangreiche Signalisierung zwischen den beiden Linien koordiniert wird. Um die regulatorische Logik hinter den zellulären Entscheidungsprozessen zu verstehen, habe ich gleichzeitig die Transkriptome und Chromatinzugangsprofile in 10.335 einzelnen Kernen erfasst. Dabei identifizierte ich über 90 % des protein-kodierenden Genoms von Drosophila, das im Testis transkribiert wird, mit Dynamiken, die den veröffentlichten Testis- Transkriptomen entsprechen. Darüber hinaus identifizierte ich 46.619 zugängliche Regionen über alle Zellstadien hinweg, von denen 14.577 Regionen eine differenzielle Zugänglichkeit zeigten. Durch die Nutzung beider Modalitäten konstruierte ich das erste Testis-spezifische, durch Enhancer getriebene genregulatorische Netzwerk (eGRN) und enthüllte 103 aktivierende und 44 repressierende TF-eRegulons im Testis mit Zellspezifität. Die Validierung des Testis-eGRN durch in vivo TF-Störungen der eRegulons stimmt mit ihren vermuteten Funktionen überein oder kann im Rahmen der Spermatogenese nachvollzogen werden. Darüber hinaus ist die kooperative Regulation zwischen eRegulons durch die gemeinsame Bindung an gemeinsame regulatorische Regionen gekennzeichnet, um die Expression von Sätzen differenzieller Ziele während der Spermatogenese zu induzieren. Zudem führte die linien-spezifische CRISPR-vermittelte Mutagenese entweder des kooperierenden ovo- oder klu-TFs zur Herunterregulierung ihres gemeinsamen Ziels stg, einem mitotischen Induktor. Dies zeigt, dass die Vorhersage des eGRN die Aufklärung neuer Rollen unbekannter TFs im Testis erleichtern kann. Schließlich wurde durch die Ausweitung auf Zell-Zell-Kommunikation der bisher wenig charakterisierte Wnt-Weg als aktiv im Testes vorhergesagt, insbesondere dessen nachgelagerter Effektor pan/TCF. Die in vivo-Charakterisierung zeigt, dass Wnt4 Komponenten an der Modulation der Stammzellzahlen, insbesondere der GSCs, beteiligt sind.