German Title: Mikrotubuli-assoziierte Proteine modulieren die Funktion von subpellikulären Mikrotubuli im Malariaparasiten Plasmodium berghei

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Abstract

Malaria, caused by the unicellular eukaryotic parasite Plasmodium, is transmitted through the bite of an infected Anopheles mosquito. Plasmodium has a complex life cycle that involves the development within different tissues and environments, both within the mosquito and the vertebrate host. This lifestyle requires constant adjustment in cell shape to meet the changing demands of the host environments but also fast parasite motility to evade the host immune mechanisms. In eukaryotic organisms, cell shape is often mediated by microtubules – hollow filamentous structures composed of α- and β-tubulin. Microtubule dynamics and stability are modulated by microtubule-associated proteins (MAPs). MAPs are proteins that bind either externally or internally to the microtubule lattice with the latter named microtubule inner proteins (MIPs). In Plasmodium, the dynamic shape changes and the structural stability of the parasite are mediated by subpellicular microtubules (SPMTs) that lie directly underneath the inner membrane complex (IMC) that subtend the plasma membrane of the parasite. SPMTs are characteristic for the invasive stages of the parasite and hence found in merozoites, ookinetes and sporozoites. They also play a pivotal role in the elongated, falciform-shaped gametocytes of Plasmodium falciparum, where they facilitate cell elongation and maturation. Disruption of SPMT formation, stability or number affects parasite shape and motility, underscoring their critical functional roles. Unlike the microtubules of model organisms, SPMTs exhibit remarkable stability, a property thought to be conferred by MAPs and potentially MIPs. However, the identities and specific functions of these stabilizing proteins remain largely unknown. In this study, I investigated the functional roles of several MAPs across the life cycle of the rodent-infecting Plasmodium berghei. Individual and combinatorial deletions of two MIPs – previously identified in the related parasite Toxoplasma gondii – and one potential outer MAP did not impair parasite development or transmission. Moreover, these deletions did not yield a detectable phenotype under normal conditions. However, cold assays revealed their contribution to SPMT stability under suboptimal environments, which is potentially relevant in natural settings. Exposure of MIP knockout parasites to low temperatures caused SPMT depolymerization and cytosolic dispersion, underscoring their role in maintaining intrinsic microtubule stability under suboptimal temperature conditions. In addition, I investigated the function of an external MAP, SPM3, unique to Plasmodium (and Cryptosporidium). SPM3 was previously found to be important for SPMT arrangement in the human-infecting Plasmodium falciparum. In Plasmodium berghei, spm3 deletion progressively impaired mosquito-stage development, leading to reduced motility in ookinetes and sporozoites, diminished salivary gland invasion, and defective transmission. Ultrastructure expansion microscopy and electron microscopy revealed that SPM3 is required for proper tethering of SPMTs to the IMC, which is in particular essential for the mosquito-to-vertebrate transmission stages. Collectively, these findings illuminate the mechanisms underlying both the intrinsic stability and the IMC tethering of SPMTs, highlighting the indispensable roles of SPMTs in parasite development and infectivity. These findings deepen our understanding of the structural and functional adaptations that enable Plasmodium to navigate through its life cycle and ensures a foundation for future investigations into parasite biology.

Translation of abstract (German)

Malaria wird durch den einzelligen eukaryotischen Parasiten Plasmodium verursacht und durch den Stich einer infizierten Anopheles-Mücke übertragen. Plasmodium hat einen komplexen Lebenszyklus, der die Entwicklung in verschiedenen Geweben und Umgebungen, sowohl in der Mücke als auch im Wirbeltierwirt, umfasst. Diese Lebensweise erfordert eine ständige Anpassung der Zellform, um den wechselnden Anforderungen der Wirtsumgebung gerecht zu werden, aber auch eine schnelle Beweglichkeit des Parasiten, um den Immunmechanismen des Wirts zu entgehen. In eukaroytischen Organismen wird die Zellform häufig durch Mikrotubuli vermittelt – hohle filamentöse Strukturen, die aus α- und β-Tubulin bestehen. Mikrotubuli-Dynamik und -Stabilität werden durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) moduliert. MAPs sind Proteine, die entweder von außen oder von innen an das Mikrotubuli-Gerüst binden, wobei letztere dann Mikrotubuli-innere Proteine (MIPs) genannt werden. Bei Plasmodium werden die dynamischen Formveränderungen und die strukturelle Stabilität des Parasiten durch subpellikuläre Mikrotubuli (SPMTs) vermittelt, die direkt unter dem inneren Membrankomplex (IMC) liegen, welcher wiederum direkt unterhalb der Plasmamembran liegt. SPMTs sind charakteristisch für die invasiven Stadien des Parasiten und daher in Merozoiten, Ookineten und Sporozoiten zu finden. Sie spielen auch eine zentrale Rolle in den länglichen, falciformen Gametozyten von Plasmodium falciparum, wo sie die Zelldehnung und -reifung erleichtern. Eine Störung der SPMT-Bildung oder -Stabilität wirkt sich auf die Form und Beweglichkeit der Parasiten aus, was ihre kritische funktionelle Rolle unterstreicht. Im Gegensatz zu den Mikrotubuli von Modellorganismen weisen SPMTs eine bemerkenswerte Stabilität auf, eine Eigenschaft, von der man annimmt, dass sie von MAPs und möglicherweise von MIPs verliehen wird. Die Identität und die spezifischen Funktionen dieser stabilisierenden Proteine sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In dieser Studie untersuchte ich die funktionelle Rolle mehrerer MAPs während des Lebenszyklus des Nagetier-infizierenden Plasmodium berghei. Einzelne und kombinatorische Deletionen von zwei MIPs - die zuvor in dem verwandten Parasiten Toxoplasma gondii identifiziert wurden - und einem potenziellen äußeren MAP beeinträchtigten weder die Entwicklung noch die Übertragung des Parasiten. Außerdem führten diese Deletionen unter normalen Bedingungen zu keinem nachweisbaren Phänotyp. Kältetests zeigten jedoch, dass sie zur SPMT-Stabilität unter suboptimalen Bedingungen beitragen, was unter natürlichen Bedingungen von Bedeutung sein könnte. Die Exposition von MIP-Knockout-Parasiten gegenüber niedrigen Temperaturen führte zu einer Depolymerisation von SPMT und einer Dispersion ins Zytosol, was ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrinsischen Mikrotubuli-Stabilität unter suboptimalen Temperatur-bedingungen unterstreicht. Darüber hinaus untersuchte ich die Funktion eines externen MAP, SPM3, das nur bei Plasmodium (und Cryptosporidium) vorkommt. SPM3 wurde zuvor als wichtig für die SPMT-Anordnung in den Menschen infizierenden Plasmodium falciparum befunden. Bei Plasmodium berghei führte die Deletion von spm3 zu einer fortschreitenden Beeinträchtigung der Entwicklung im Mückenstadium, was sich in einer verminderten Motilität der Ookineten und Sporozoiten, einer verringerten Speicheldrüseninvasion und einer gestörten Übertragung niederschlug. Ultrastrukturelle Expansionsmikroskopie und Elektronenmikroskopie zeigten, dass SPM3 für die ordnungsgemäße Bindung der SPMTs an den IMC erforderlich ist, was insbesondere für die Übertragungsstadien von der Mücke zum Wirbeltier wichtig ist. Zusammenfassend beleuchten diese Ergebnisse die Mechanismen, die sowohl der intrinsischen Stabilität als auch der IMC-Bindung von SPMTs zugrunde liegen, und unterstreichen die unver-zichtbare Rolle von SPMTs bei der Entwicklung und Infektiosität von Parasiten. Diese Erkennt-nisse vertiefen unser Verständnis der strukturellen und funktionellen Anpassungen, die es Plasmodium ermöglichen, sich durch seinen Lebenszyklus zu bewegen, und bilden eine Grundlage für künftige Untersuchungen der Parasitenbiologie.