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Abstract

Recording the activity of large neuronal populations is crucial for understanding brain function but is constrained by current technologies. Multiphoton microscopy (MPM) with calcium-sensitive fluorescence sensors offers sub-cellular imaging of neuronal activity but is limited to ~1 mm depth and a narrow field of view. Functional magnetic resonance imaging (fMRI), despite whole-brain coverage, uses blood-oxygenation as a neural activity proxy and suffers from poor spatial (~0.4 mm) and temporal (~1 sec) resolution.

Photoacoustic imaging (PAI) uniquely combines the molecular contrast of light absorbance with ultrasound imaging, thereby achieving ~cm penetration and bridging the scales of MPM and fMRI. Combined with calcium probes tailored for photoacoustic emission, PAI could enable brain-wide calcium imaging, advancing neurobiological research. However, suitable far-red (600–700 nm) calcium reporters are currently unavailable.

This thesis presents advancements toward whole-brain neuroimaging using photoacoustic methods. A custom Fabry-Perot-based Photoacoustic Tomography system (FP-PAT) was developed, enabling 3D brain tissue imaging with a 15*15*15 mm³ field of view and ~90 μm spatial resolution. System improvements in speed and sensitivity are introduced to make it suitable for calcium imaging applications.

Novel calcium photoacoustic reporters based on synthetic dyes and HaloTag-based self-labeling proteins were developed in collaboration with the Deo lab at EMBL. A multimodal spectroscopy platform combining photoacoustic, absorption, and fluorescence readouts was designed to screen and characterize these probes. Selected probes were then tested in tissue-mimicking phantoms with FP-PAT, demonstrating superior performance in signal intensity, sensitivity, and photostability compared to existing calcium sensors.

Next, we demonstrated successful in vivo labelling and PA imaging of mouse brain slices, thereby showing the feasibility of using HaloTag-based probes to label neurons and detect the signal with FP- PAT. Moreover, preliminary data on a calcium-sensitive version of the probe, HaloCaMP, shows successfully labeled mouse brain slices with a detectable change in signal after incubation in calcium buffer.

Finally, acute slice preparation and PAI were used to assess calcium sensors in live tissue stimulated with high potassium. Proof-of-concept data for the fluorescent calcium indicator jGCaMP8m showed detectable PA signal changes upon stimulation. However, the HaloCaMP probe did not yet demonstrate calcium-mediated signal changes, likely due to low calcium affinity and brightness of this first-generation sensor.

This work introduces a novel class of far-red photoacoustic calcium reporters with superior performance, providing critical spectroscopic characterization and methods for labeling mouse brain tissue. While challenges remain for realistic in vivo applications, this research establishes a foundation for developing photoacoustic neuroimaging with tailored calcium sensors, paving the way for future in vivo brain-wide calcium imaging.

Translation of abstract (German)

Das Aufzeichnen der Aktivität großer Neuronenpopulationen ist entscheidend für das Verständnis der Gehirnfunktion, ist jedoch durch aktuelle Technologien nur eingeschränkt möglich. Multiphotonenmikroskopie (MPM) mit kalziumsensitiven Fluoreszenzsensoren ermöglicht subzelluläre Bildgebung neuronaler Aktivität, ist jedoch auf ~1 mm Tiefe und ein schmales Sichtfeld begrenzt. Die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) bietet gehirnweite Abdeckung, nutzt jedoch Sauerstoffsättigung als Proxy für neuronale Aktivität und hat geringe räumliche (~0,4 mm) und zeitliche (~1 Sek.) Auflösung.

Die photoakustische Bildgebung (PAI) kombiniert Lichtabsorption mit Ultraschallbildgebung (~cm Eindringtiefe) und überbrückt so die Skalen von MPM und fMRT. Mit angepassten Kalziumsonden könnte PAI gehirnweite Kalziumbildgebung ermöglichen, allerdings fehlen geeignete Kalziumreporter im fernroten Bereich (600–700 nm).

Diese Arbeit präsentiert Fortschritte in der gehirnweiten Neurobildgebung mittels PAI. Ein Fabry-Pérot-basiertes Photoakustisches Tomographiesystem (FP-PAT) wurde entwickelt, das 3D-Bildgebung von Hirngewebe mit einem Sichtfeld von 15x15x15 mm³ und ~90 μm Auflösung ermöglicht. Verbesserungen in Geschwindigkeit und Empfindlichkeit machen es für Kalziumbildgebung geeignet.

Neu entwickelte photoakustische Kalziumreporter auf Basis synthetischer Farbstoffe und HaloTag-Sonden wurden in Zusammenarbeit mit dem Deo-Labor am EMBL getestet. Eine speziell entwickelte, multimodale Spektroskopieplattform zur Charakterisierung von Sonden zeigte, dass ausgewählte Reporter in Phantomen mit FP-PAT hinsichtlich Signalintensität, Empfindlichkeit und Stabilität überlegen sind.

Wir zeigten in vivo Markierungen und PA-Bildgebung von Mausgehirnschnitten mit HaloTag-Sonden, was die Machbarkeit der neuronalen Markierung und Signaldetektion mit FP-PAT unterstrich. Erste Tests der kalziumsensitiven Sonde HaloCaMP zeigten nach Inkubation in Kalziumpuffer ein detektierbares Signal.

Akute Gewebeschnitte und PAI wurden verwendet, um Kalziumsensoren in lebendem Gewebe unter Kaliumstimulation zu testen. Der fluoreszierende Kalziumindikator jGCaMP8m zeigte nachweisbare PA-Signaländerungen, während HaloCaMP aufgrund niedriger Affinität und Helligkeit noch keine kalziumvermittelten Signale zeigte.

Diese Arbeit führt neuartige photoakustische Kalziumreporter im Fernroten Bereich ein und präsentiert wichtige Charakterisierungen und Methoden zur Markierung von Mausgehirngewebe. Trotz verbleibender Herausforderungen für in vivo-Anwendungen bildet diese Forschung die Grundlage für zukünftige gehirnweite Kalziumbildgebung mit PAI.