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Abstract

Raman-basierte Lichtscheibenbildgebung von 3D-Zellkulturen ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das durch hochwertige, anwendungsspezifische Messkonzepte vorangetrieben wird. Der Raman-Effekt bietet markierungsfreien Einblick in die molekulare Zusammensetzung von Proben und ermöglicht zerstörungsfreie, minimalinvasive Beobachtung dreidimensionaler Zellverbände. Der entwickelte multimodale Mikroskop-Prototyp wird durch Rayleigh-Streuung und Fluoreszenz-markierung ergänzt. Die schwache Signalstärke der Raman-Streuung ist eine fundamentale Herausforderung, die durch einen speziellen Aufbau mit wellenlängenselektiver Bilddetektion gelöst wird. Isolierte Parameterstudien ergaben, dass mit der Emissionswellenlänge 785 nm die Anregungsleistung für die Detektion der Stokes-Streuung auf unter 35 mW verringert und bei Emissionswellenlänge 532 nm auf 1 mW reduziert werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass diffusionsgetriebene molekulare Konzentrationsunterschiede sowie quantifizierbare Konzentrationsunterschiede ab 9,6 mmol/l messbar sind. Erste Raman-basierte, molekülspezifische Bilder wurden bereits aus Punktraster-Messreihen rekonstruiert. Laser mit 660 nm und 785 nm Emissionswellenlänge ermöglichen mit dem Mikroskop eine Detektion über breite Spektralbereiche. Ein innovativer Probenhalter für Sphäroidproben in Hydrogelen verbessert die Probenvorbereitung und Reproduzierbarkeit räumlicher Positionierung. Kosteneffizientes 3D-Drucken erlaubt die Anpassung an unterschiedliche Sphäroid-Durchmesser. Ein acousto-optic tunable filter (AOTF) ermöglicht eine rasche, stufenlose Auswahl von Spektralbereichen mit einer Auflösung von 56 cm-1. Die Objektive ergeben ein Sichtfeld von 635 μm x 635 μm und erlaubt die Untersuchung vieler Sphäroide. Durch Erhöhung der optischen Ausgangsleistung und Verringerung der Wellenlänge der Anregungslaser kann die Signalintensität erhöht werden. Höhere flächenspezifische Lichtintensität in der Probe erhöht allerdings das Risiko strahlungsinduzierter Schäden, was die Integrität der Zellen beeinträchtigen kann. Das Mikroskop ermöglicht die Bildgebung unmarkierter Molekülverbindungen zwischen 2700 cm-1 und 3000 cm-1 und liefert Informationen über Moleküle mit Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen. Die Unterscheidung verschiedener Peptide ist durch Anpassungen erreichbar. Alternative Varianten der Lichtscheiben-Raman-Mikrospektroskopie erlauben die Bestimmung von Lipideinlagerung und verbrauch, Zelldichte und Wassergehalt. Die hier entwickelte Kombination von Lichtscheiben-beleuchtung mit verschiedenen Streueffekten in einem Gerät ist bislang einzigartig. Die Raman-basierte Lichtscheiben-Bildgebung bietet großes Potenzial für die Erforschung von 3D Zellinteraktionen. Sie ermöglicht die zerstörungsfreie Beobachtung von Zellkulturen und die Gewinnung molekularer Informationen, was neue Erkenntnisse über Arzneimittelwirkungen, Stoffwechsel, genetische Störungen und Zellwachstum liefern kann. Das entwickelte Mikroskop ist hierfür geeignet und kann durch Ergänzung eines Lasers mit 532 nm Emissionswellenlänge erweitert werden, um schwächere Raman-Peaks detektierbar zu machen. Dies erhöht die Spezifität und Vielseitigkeit der 3D-Zellkulturbildgebung. Gegenwärtig wird eine hochempfindliche OrcaFlash 16-Bit-Kamera verwendet, wobei künftige Iterationen Bildverstärker beinhalten könnten. Zukünftige Anwendungen könnten die Untersuchung von Carbonsäuren, Wasserverteilungen und deuterierten Proben umfassen. Auch die Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix und die Unterscheidung von apoptotischen und nekrotischen Abläufen könnten darstellbar werden.