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Abstract

Cells have to adapt rapidly to changing physiological demands, such as differentiation, stress and disease. Extensive studies have defined many stress response pathways at the level of gene activity and protein abundance, but stress-induced changes of protein subcellular localization have not been investigated comprehensively on a proteome-wide level. In this thesis, I established and applied the Dynamic Organellar Maps (DOMs) approach by label-free mass spectrometry for the first time to yeast. DOMs detected protein localization changes of native, untagged proteins upon different stresses. Firstly, I used endoplasmic reticulum (ER) stress and found that almost 10% of the known proteins expressed in yeast, shifted within or between organelles. I showed that a distinct multitude of secretory pathway proteins accumulated in the ER. In-depth analysis and experimental validation refined the extent and selectivity of misfolded proteins retained in the ER. Moreover, I identified new ER proteins subjected to the ER reflux pathway and identified transmembrane components of reticulon clusters, which separated from the residual ER. Lastly, I demonstrated that nuclear pore complex integrity was altered which affected nuclear import. Secondly, I applied DOMs to nitrogen-starved cells to identify novel cargo proteins which were degraded by non-selective macroautophagy. I detected several proteins which were already known to be autophagic cargos or to be involved in cargo recruitment and transport. Further analysis provided a list of candidate cargo proteins which serve as a basis to determine if starvation induced autophagy degrades cargo proteins non-selectively. In conclusion, I established DOMs in yeast and revealed that global and suborganellar changes in protein localization are key elements of cellular stress responses.

Übersetzung des Abstracts (Deutsch)

Zellen müssen sich schnell an verändernde physiologische Anforderungen wie etwa Differenzierung, Stress und Erkrankungen anpassen. In umfangreichen Studien wurden viele Stressreaktionswege auf der Ebene der Genaktivität und der Häufigkeit von Proteinen definiert, allerdings wurden stressbedingte Veränderungen der subzellulären Lokalisierung von Proteinen bisher nicht umfassend auf Proteom--Ebene untersucht. In meiner Doktorarbeit habe ich die Methode, Dynamic Organellar Maps (DOMs), mithilfe unmarkierter Massenspektrometrie in Hefe etabliert und angewandt. Mit DOMs wurden Veränderungen der Proteinlokalisierung von nativen, nicht-markierten Proteinen unter verschiedenen Stresssituationen untersucht. Zunächst habe ich das endoplasmatische Retikulum (ER) gestresst und festgestellt, dass sich fast 10 % der bekannten Proteine, die in Hefe exprimiert werden, innerhalb oder zwischen den Organellen bewegen. Ich zeigte, dass sich eine Vielzahl von Proteinen des sekretorischen Weges im ER anreicherten. Eine eingehende Analyse und darauffolgende experimentelle Validierung präzisierten das Ausmaß und die Selektivität der im ER zurückgehaltenen fehlgefalteten Proteine. Darüber hinaus habe ich neue ER-Proteine identifiziert, die dem ERReflux unterworfen sind, und Transmembrankomponenten von Retikulon-Clustern identifiziert, die sich vom restlichen ER abgetrennt haben. Schließlich konnte ich zeigen, dass die Integrität des Kernporenkomplexes verändert war, was sich auf den Kernimport auswirkte. Zweitens wandte ich DOMs in Zellen an die unter Stickstoffentzug litten, um neue Zielproteine zu identifizieren, die durch nichtselektive Makroautophagie abgebaut werden. Ich fand mehrere Proteine, von denen bereits bekannt war, dass sie Zielproteine von Autophagie sind oder an der Rekrutierung und dem Transport von ihnen beteiligt sind. Weitere Analysen ergaben eine Liste von potentiellen Kandidaten, die als Grundlage dienen, um zu bestimmen, ob die durch Nährstoffmangel induzierte Autophagie Zielproteine nicht-selektiv abbaut. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich erfolgreich DOMs in Hefe etabliert habe. Ich konnte zeigen, dass globale und suborganellare Veränderungen der Proteinlokalisierung Schlüsselelemente zellulärer Stressreaktionen sind.