German Title: Die verborgene Syntax des AAV: Einblicke in die epigenetische Regulation und Entdeckung eines Dinukleotid-Musters im Adeno-assoziierten Virus (AAV)

Preview

PDF, English Download (13MB) | Terms of use

Abstract

Recombinant Adeno-associated Virus (rAAV) is an auspicious gene-delivery vector for human gene therapy. Even though there are multiple approved rAAV-based drugs available, many underlying molecular mechanisms remain uncertain. This thesis is dedicated to the investigation of two related areas of AAV's biology: (i) investigation of epigenetic regulation of delivered DNA comparing two distinct AAV vector capsids, and (ii) exploration of a sequence pattern conserved for the genus Dependoparvovirus, which may contribute to improved transgene cassette design.

AAV-delivered DNA mainly persists as circular episomal DNA within the nuclei of transduced cells. The extent of epigenetic regulation that the transduced cells enact on the delivered vector DNA and the influence of the capsid are severely understudied. In a long-term mouse model experiment, I found that the DNA methylation in the formed episome is negligible using nanopore sequencing. However, histone modifications were differentially deposited on AAV2- and AAV9-delivered episomes. At later timepoints, expression-beneficial histone acetylations on the AAV9-delivered transgene became lost, and its expression was repressed. AAV2 appeared to have an expression-permissive regulation, but was being held back by its unpacking speed.

In the second part of this work, I describe the discovery of a pronounced 15 bp YY/RR dinucleotide pattern unique to the genus Dependoparvovirus. It resembles the 10 bp histone-positioning code in eukaryotic genomes, but the longer repeat length likely enables a different binding partner, potentially those involved in viral replication or packaging. The biological importance of this pattern was demonstrated through its enrichment during the selection of shuffled AAV cap sequences. Additionally, I could show that rAAV vectors that contained sequences with the wild-type periodicity produced higher titers in a small-scale production system, suggesting a functional role necessary for vector production. Based on the evidence provided, an increased interaction of the DNA with Rep proteins is a likely explanation for the presence of this pattern. The described pattern could be harnessed in the future to improve rAAV transgene cassette designs.

Translation of abstract (German)

Rekombinante Adeno-assoziierte Viren (rAAV) stellen vielversprechende Vektoren für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen dar. Obwohl bereits mehrere rAAV-basierte Arzneimittel zugelassen sind, bleiben viele zugrunde liegende molekulare Mechanismen bislang unzureichend verstanden. Diese Arbeit widmet sich zwei miteinander verbundenen Aspekten der AAV-Biologie: (i) der Untersuchung der epigenetischen Regulation des übertragenen DNA-Materials in Abhängigkeit zweier unterschiedlicher AAV-Kapsidvarianten sowie (ii) der Analyse eines konservierten Sequenzmotivs innerhalb der Gattung Dependoparvovirus, welches zur Optimierung von Transgen-Kassetten beitragen könnte.

Nach der Transduktion liegt die AAV-vermittelte DNA überwiegend als zirkuläres episomales DNA-Molekül im Zellkern der Zielzellen vor. Die epigenetischen Veränderungen, welche die transduzierten Zellen auf das Vektor-DNA-Material übertragen, sowie der Einfluss des Kapsids darauf sind bislang nur unzureichend erforscht. In einem langfristig angelegten Experiment in Mäusen konnte ich mittels Nanopore-Sequenzierung zeigen, dass die DNA-Methylierung auf den gebildeten Episomen vernachlässigbar ist. Dagegen wurden deutliche Unterschiede in der Deposition von Histonmodifikationen auf durch AAV2 bzw. AAV9 übertragenen Episomen beobachtet. Zu späteren Zeitpunkten gingen für die Genexpression förderliche Histon-Acetylierungen auf AAV9-vermittelten Transgenen verloren, was mit einer Repression der Transgenexpression einherging. AAV2 hingegen zeigte eine expressionsförderliche epigenetische Regulation, war jedoch durch eine verlangsamte Entpackung des Genoms limitiert.

Im zweiten Teil der Arbeit beschreibe ich die Entdeckung eines ausgeprägten, 15 Basenpaare umfassenden YY/RR-Dinukleotidmusters, das einzigartig für die Gattung Dependoparvovirus ist. Dieses Muster ähnelt dem 10 bp langen Histon-Positionierungscode eukaryotischer Genome, weist jedoch eine größere Periodenlänge auf, was auf einen anderen Bindungspartner hindeutet – möglicherweise zusammenhängend mit viraler Replikation oder Verpackung. Die biologische Relevanz dieses Musters zeigte sich in dessen Anreicherung während der Selektion rekombinierter AAV-cap-Sequenzen. Darüber hinaus konnte ich nachweisen, dass rAAV-Vektoren mit Sequenzen, die die wildtypische Periodizität aufwiesen, in einem verkleinertem Produktionssystem höhere Titer erzielten. Das lässt auf eine funktionelle Rolle des Musters bei der Vektorproduktion schließen. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass eine verstärkte Interaktion der DNA mit Rep-Proteinen die Existenz dieses Musters erklären könnte. In Zukunft könnte dieses Muster genutzt werden, um rAAV-Transgenkassetten zu optimieren.